196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 196236 2 ló térfogatú puffert [0,1 mól trisz-HÖ, 0,1 mól fiziológiai konyhasó [NaCl], 0,1 súly. térfogat % 2-merkaplo-etanol, 0,1% marha szérum albumin 0,001 mó! EDTA] tartalmazó eleggvc! hígítunk és a pH-t 7 ,4-re állítjuk be. Az elegyet 35 000 percenkénti fordulatszámmal 2 óráig centrifugáljuk 4°C~ on. Az így kapott pelletet ismét szuszpendáljuk 200 pl azonos pufferben és 20% szacharózt tartalmazó centrifuga cső tetejére rétegezzük. A szuszpenziót 40000 percenkénti fordulatszám mellett 2 óráig 4 °C-on centrifugáljuk. Az így kapott pelletet ismét szuszpendáljuk 100 pl pufíerben (0,i mól trisz-HQ, 0,1 mól fiziológiai sóoldat) pH=7,5 értéken. A kapott DNS-taríaimú pelletet ezután megjelöljük 3H-val vagy 32P~vel [P. M. Kaplan és társai, „DNA Polymerase Associated With Human Hepatitis B Antigen”, J. Virol, 12, 995—1005 o, (1973)] és így könnyebben követhetjük az eljárás egymást követő lépéseit. Ezt a jelzést a koncentrált Dane-részecskék és a 3H-val vagy 32P-vel megjelölt dezoxiukleozid- trifoszfátok (dNTP) 4 óráig 37 °C- on lefolyó reakciójából kapjuk. A DNS polimeráz reakció után, amely részben betölti a DNS-bcn az egyszálú hézagot (lásd. 1. ábra), a jelzett DNS- anyagot a 30% szacharózt tartalmazó centrifugacső tetejére rétegezzük és 42000 fordulatszám mellett 3 és fél óráig 4°C-on centrifugáljuk 42000 percenkénti fordulatszámmal. A DNS-t ezután a pelletből fenollal extraháljuk. [L. L Lutwick és W. S. Robinson, „DNASynthesized ín The Hepatitis B Dane Particle DNA Polymerase Reaction”, J. Virol, 21, 96—104 o. (1977)]. Az extrahált DNS-t ezután 0,01 mól trisz-HCI-i, 0,001 mól EDTA-t (pH=8,0) tartalmazó oldattal szemben a fenol oldószer eltávolítására dializáljuk. Az izolált DNS ekkor készen ál! a restrikciós enzimes lebontásra. Fajlagos radioaktivitása ~ 108 cprn/pg. A fent leírt folyamatot a 2., ábra szemlélteti sematikusan. A hepatitisz B vírus DNS klónozása A gazda-kiónképző hordozó kombinációinak széles skáláját használhatjuk a fent leírt módon izolált kettős szálú DNS klónozására. így pl. hasznosak az olyan klónképző hordozók, mint a kromoszomális vagy nemkromoszomális és szintétikus DNS szekvenciák pl. különböző ismert plazmidok, pl. pBR322, vagy más E. coli plazmidokés származékaik; szélesebb gazda tartományú plazmidok pl. RP4; fág DNS-ek, a X fág különböző származékai pl. az NM899 és a plazmidok és DNS fág kombinációjából származó vektorok, pl. fág DNS kifejeződést szabályozó szekvenciák alkalmazására módosított plazmidok. A hasznos gazdák lehetnek baktérium gazda sejtek, pi. E. coli, XÍ776, E. coli, X 2282, E. coli, HB101 és E. coli, MRCI és Pseudomonas, Bacillus subtilis törzsek, és más baktériumok, élesztő- és más gomba-, állati vagy növényi gazda sejtek, pl. állati vagy növényi sejtíenyészetek és más gazda sejtek. Nern minden gazda egyformán hatásos természetesen. A gazdakiónképző hordozó kombináció kellő kiválasztása fentiek figyelembevételével a szakember feladata. Minden egyes vektoron belül különböző helye- • ket választhatunk ki áz izolált kettős szálú DNS beillesztésére. Ezeket a helyeket rendszerint annak a restrikciós enzimnek vagy az endonukleáznak a nevével jelöljük meg, amely a hasítást végzi. Így pl. a pBR322 plazmádban a Pst I hely a penicilíináz génjében helyezkedik el a penicillináz protein 181. és 182. aminosavait kódoló nukleotid triplettek között. Ezt a helyet használták Villa— Komaraff és társai a patkány proinzulin antigén determinánsokat mutató protein szintézise során. A Hind í í endonukleáz felismerő hely az pBR322 protein 101. és 102. aminosavait kódoló triplettek között és a Tag hely a 45. aminosavját kódoló triplettnél található. Hasonló módon a plazmid Eco RÍ endonukleáz felismerő helye a tetraeiklinnel és ampicilinne! szemben mutatott rezisztenciát kódoló gének között van. Ezt a helyet használták Bakura cs társai és Goedde! és társai rékombináns DNS szintézis vázlataikban (lásd fent). A 2. és 11. ábra néhány restrikciós helyet mutat a plazmid pBR322 piazmidban és a X NM989 fágban. Számos tényező befolyásolja annak a helynek a kiválasztását, ahol a kiválasztott DNS fragmente! a klónképző hordozóba beépítjük a rékombináns DNS molekula képzése céljából. Ezek a tényezők pl. a kifejezni kívánt poüpeptid mérete és szerkezete, a poüpeptid érzékenysége a gazdasejt komponensei által történő endoenzimatikus lebontásra, kifejeződési jellemzők, pl. a start és stop kodonok elhelyezkedése és a szakember számára nyilvánvaló más tényezők. Mivel a kifejeződési folyamat még nem teljesen tisztázott, egyik felsorolt tényező sem szabja meg önmagában a poiipeptid beillesztésének helyét, inkább a választott hely befolyásolja a tényezők egyensúlyát és nem minden hely egyaránt hatásos egy adott protein esetében. Bár számos módszer ismeretes az irodalomban idegen DNS beillesztésére klónképző hordozóba rékombináns DNS molekula képzésére, a találmány szerinti előnyös módszert a 2. ábra szemlélteti. Az eljárási az jellemzi, hogy a Dane-részecske DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítjuk, polidezoxi C-szekvendiákat kapcsolunk a lehasított DNS 3'-végéhez (a DNS cukor váz dezoxiribóz szénatoméról elnevezve) és a meghosszabbított DNS-t olyan klónképző hordozóhoz kapcsoljuk, amely egy adott helyen restrikciós endonukleázzal hasított és ennek a hasításnak 3' végénél poli-dezoxi G-vel meghosszabított. Ez a poldezoxi C szekvencia komplementer a hasított DNS-t hosszabbító poli-dezoxi C szekvenciával, A DNS és a klónképző hordozó 3'-végeinek komplementer jellege engedik a terminális részek kohézióját. A találmány szerinti eljárásban célszerű olyan restrikciós enzimet választani DNS hasítására, amely enzim a HBV antigenicitást mutató polipeptideket kódoló gén lényeges részében nem hasítja a HBV DNS-t és legelőnyösebben csak korlátozott szánni helyen hasítja a DNS-t. A találmány szerint az alábbi restrikciós enzimeket használjuk: Kpn I, fígl II, Bam Hl, Ava I és Eco Rí. Más restrikciós enzimek is hasznosak lehetnek a találmány szerint. Az enzimet a szakembernek a fent felsorolt tényezők figyelembevételével kell kiválasztani. A 3—9. ábrák a HBV gettómban lévő néhány restrikciós endonukleáz felismerő helyet ábrázolják. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
