196236. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis B vírus antigenicitást mutató polipeptidek előállítására
1 198236 2 Természetesen más ismert módszer is alkalmazható DNS molekulák kialakítása céljából. Ilyen pl. a közvetlen ligáció, ahol ugyan azt a restrikciós endonukleázt használják a HBV DNS és a klónképző hordozó hasítására. Ezzel az eljárással egyben komplementer végeket kapunk a kohézióhoz. Természetesen magától értetődik, hogy a klónkcpzó hordozó kiválasztott restrikciós helyén beépített nukleotid szekvencia vagy gén fragment olyan nukleotidokat is magában foglalhat, amelyek nem képezik a valódi Struktur gén részét a kívánt protein esetében vagy a Struktur génnek csak egy fragmentjét foglalják magukban. Csak az szükséges, hogy bármilyen DNS épül is be, a transzformált gazdasejt HBV antigenicitást mutató polipeptidet termeljen. A hibrid gént tartalmazó rekombínáns DNS molekulát alkalmazhatjuk a gazdasejt transzformálásra, úgy hogy a gazdasejt (transzformáns) a Struktur gént vagy fragmentjét fejezze ki és olyan polipeptidet vagy részét termelje, amelyet a hidrid DNS kódol. A rekombináns NDS molekula a gazdasejtet úgy is transzformálhatja, hogy a gazdasejt replikációval további rekombináns DNS molekulát termeljen mint a HBV struktúrgének és fragmentjeik forrását. A fenti céloknak megfelelő gazda kiválasztása számos, az irodalomból ismert tényezőtől függ. Ilyen tényezők pl. kompatibilitás, a melléktermékek toxicitása, a polipeptid termék kinyerésének egyszerűsége, kifejeződési jellemzők, biológiai biztonság és költségek. Mivel a kifejeződés mechanizmusa még nem teljesen felderített, a speciális rekombináns DNS molekulához vagy polipeptidhez a gazdasejtet nem lehet tökéletesen megválasztani kizárólag a fenti faktorok alapján. A tényezők egyensúlyát kell megtalálni annak felismerése mellett, hogy nem minden gazdasejt hat egyformán egy adott rekombináns DNS molekula kifejeződésére. A találmány szerinti szintézisben az előnyös kiónképző hordozó a bakteriális pBR322 plazmid és ebben az előnyös restrikciós endonukleáz hely a Pst 1 hely (2. ábra). Ez a plazmid kb. 2,6 megadalton molekula súlyú kis plazmid, amely az ampicillin (Amp.) és tetraciklin (Tét) antibiotikumokkal szemben mutatott rezisztencia géneket hordozza. A plazinidot teljesen jellemezték (F. Bolivar és társai: „Construction and Characterization of New Cloning Vehicles II. A Multipurpose Cloning System”, Gene 95— 113 o. (1977)). A találmány szerinti legelőnyösebb gazdasejl az E. coli HB 10i. 1. dC-vel meghosszabbítón Dane-részecske DNS előállítása A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint a fent leírt módon Danerészecskéből izolált D.NS-t Kpn I restrikciós nukieázzal (kb. 20 ng DNS 10 pl 10 mmólos trisz-HCl, pH=7,5, 10 mmólos magnézium-klorid, 10 mmólos 2-merkapto etanol, 40 mmólos nátrium-klorid, 0,5 pl enzim készítmény elegyében) 37°C-on 90 percig emésztjük és a restrikciós enzimet 70 °C-on történő melegítéssel 5 percig inaktiváljuk. Az emésztés után kapott terméket 3' végéhez (a 2. ábrán CCC-nek jelölve) polinukleotid terminális transzferázzal* végzett standard reakcióval polide- Zoxi-C szekvendiákat kapcsoltunk, miután a maradék proteint 20 pl fenollal és 20 pl kloroformmali extraháltunk és eltávolítottuk. A fenolt éteres extrakcióval távolítottuk el a vizes fázisból és a DNS-t 5 pl 6,5 pH-értékű 3 mólos nátrium-acetát cs 0,1 ml hideg etanoi hozzáadásával kicsaptuk. Egy óráig -70°C-on tároljuk, majd a kicsapott DNS-t percenként 10000 fordulatszámmal 20 percig centrifugálva izoláltuk és a pelletet 10 pl 10 mmólos pH=7,5 értékű trisz-HCl-ben oldottuk. Ehhez 3 pl 400 mmólos kálium-kakodiláiot, pH=7,0, 4 mmólos kobaltkloridot és 4 mmólos dezoxieitozin-trifoszfátot (dCTP), 200 pl/ml marhaszérum-albumint tartalmazó elegyet adagoltunk és az elegyet 27°C-on 10 percig 0,5 pl polinukleotid terminális transzferázzal (6000 egység/ml) indukáljuk és a reakciót 50 mmólos EDTA l pl-ének hozzáadásával megállítottuk. 2. Pst l-gyel hasított, dC-vel meghosszabbított pBR322 előállítása A pBR322 plazmidot Pst I restrikciós endonuk- leázzal elbontjuk (amely számára plazmid egy célpontot tartalmaz) és a terméket fenolos extrakcióvai és etanolos kicsapással tisztítjuk a HBV— DNS-nél megadott módon. A poli-dó szekvendiákát (illusztráció céljából lásd. a 2. ábrán a GGG-t) terminális transzferázzal a lineáris pBR322 molekulát 3' végéhez kapcsoljuk, ugyanúgy, ahogy a poli-dC szekvenciákat kapcsoltuk össze a HB V-vel azzal a különbséggel, hogy a reakciót 37°C-on végeztük el. 3. Poli-G-vel meghosszabbított pBR322 és poli- C-vel meghosszabbított HBV DNS kohéziója Ekvimoláris mennyiségű pBR322-poli-dG-t és HBV-DNS-poli-dC-t összekeverünk és a komplementer szekvenciákat 50 ml TNE-keverékben TNE: 100 mmólos nátriumklorid, 50 mmólos trisz- HCl, -pH=7,5, 5 mmólos (EDTA) 65°C-on 1 óráig, majd 47 °C-on l óráig, majd 37°C-on 1 óráig és 20 C-on egy óráig inkubálva összekapcsoljuk és még egyenlő térfogatú TNE-t és 20 pl 100 mmólos inagnéziumklorid, 100 mmólos kalciumklorid, 100 mmólos trisz-HCl (pH=7,5) keveréket adunk hozzá. 4. E. coli HBW1 transzformálása Transzformációhoz alkalmas E. coli HB 101 kultúrákat állítottunk elő E. M. Ledírberg és S. H. Cohen „Transformation of Salmonella typhymuri- uni by plasmid Deoxyribonucleic Acid”, J. Bacte- riol., 119, 1072 — 1074 o. [1974] közleménye szerint. A sejtek 0,1 ml-es adagjait 25 pl temperált DNS készítménnyel összekeverjük és 0°C-on 20 percig, majd 20°C-on 10 percig inkubáljuk mielőtt 50 pg/ml tetraciklint tartalmazó L-agar-lemezefo * (Nucleic Acids Research, 3. 101 —15 a, (1976)) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
