196217. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vinblasztin-fehérje konjugátumok és származékaik, valamint ilyen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 196 217 2 Tömegspektrum (DCI-izobután): 939 (M+), 940 (M++l) IR spektrum (KBr): 1740,1675.1615 cm-' NMR spektrum (CDC13, 360 MHz) Ô: 9,25 (OH), 8,02 (NH), 7,50 (H-9'), 7,16-7,05 (H-10'. H—U', H—12'), 6,61 (H-9), 6,52 (NH). 6,08 (H—12), 5,82 (H—14), 5,47 (H-17), 5,28 (H- 15), 4,75 (CH-NHAc), 3,93, (H-17A'), 3.77 (2xOMc), 3,60 (OMc), 2,70 (NMe), 2,02 (MeCo—), 0,95-0,77 (2 Mc) Rf: 0,39 (CÉL CL: CH3OH=90:10szilikagcl) 2. példa Alfa- és gamma 4-0-dezaceiil-4-fí-L-N-benzil-oxikarbonil-hcmi-glitiunuít-vinblasztin 300 mg (0,39 mól) 4-0-dczacctil-vinblasztint és 114 mg (0,519 mmól) N-karbobcnzil-oxi-L-glutaminsavanhidridet 5 írd diklór-mctánban oldunk és szobahőmérsékleten 20 órán át keverjük. Ezután az oldószert vákuumban Icdcsztilláljuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (étcr/metanol/25%-os ammónium-hidroxid, 50/ 49,5/0,5), amikoris 230 mg alfa és béta 4-0-dczncetil-4-0-L-N-karbobenzil-oxi-hemiglutamát-vinblasztint nyerünk, amely az a és y izomerek keveréke és ezek aránya az elvégzett HPLC kromatográfiás adatok szerint 60:40. ÍR spektrum (KBr): 3450, 2960, 2880,1730,1612, 1593,1501,1459,1432,1228 cm-1. Tömegspektrum (DCI-izobután): 1032 (M+ + l), 984,928,723 cm->. 3. példa 4-0-dezacetil-4-0-L-N-acetil-hem'uiszpartái-vinblasztin és humán eredetű galaktozilált albumin kapcsolása a) 80,6 g 4-0-dezacctil-4-0-L-N-acctiÍ-hcmiaszpartát-vinblasztint 2 ml dioxánban oldunk, jégfürdőben lehűtjük, hozzáadunk 0,5 ml dioxánban oldott 24,4 /d trictil-amint cs 0,5 ml dioxánban oldott 22,6 pl klór-hangyasavas-izobutil-észtcrt és a kapott reakciókeveréket 1 órán át keverjük. Közben 37 ml vízben feloldunk 200 mg galaktozilált humán aibumint a pH értékét 0,1 n nátriumhidroxidda! 8,5-es értekre beállítjuk, majd az clegyet hűtőszekrényben 4°C-on tároljuk. 1 óra elteltével a fenti aktivált észtert hozzáadjuk az oldathoz, 4°C-on 14 órán át keverjük, miközben a pH értékét 0,1 n nátrium-hidroxid adagolásával 8,5-es értéken tartjuk. Ezután az oldatot 9 ezrelékes nátriunl-kloriddal kiegyensúlyozott Scphadcx gél G 25-ön szűrjük (pH = 7,5), a konjngátumokat tartalmazó frakciókat egyesítjük, ultracentriiíigálással betöményítjük és sterilizáljuk. A fehérjetartalmat a Lowry módszerrel, az alkaloidtartalmat a radioaktivitásmérésscl határozzuk meg. A kapott konjugátum 13 mól vinblasztint tartalmaz 1 mól galaktozilált humán albuminra vonatkoztatva és a HPLC segítségével 82% monomer és 18% dimer konjugátum mutatható ki. Rctenciós idő: 20167 (HPLC; Sorbax G. F. 250 és GF 450 ■ töltetű oszlopon meghatározva). b) 80,6 ing 4-O-dczacctil-4-0-L-N-accíil-hemiaszpartát-vinblasztint 2 ml dioxánban oldunk, majd jégfürdőn lehűtjük cs hozzáadunk 0,5 ml dioxánban oldott 24,4 p\ trictil-amint és 0,5 ml dioxánban oldott 22,6 pl klór-hangyasavas-izobutil-észtert. Ezután 200 mg galaktozilált humán albumint feloldunk 37 ml 0,1 mólos foszfát pufferban, (pH = 8,2) cs a pH-t 1 n nátrium-hidroxiddal 8,5-ös értékre beállítjuk. A kapott oldatott 4°C-on tároljuk, majd i óra elteltével hozzáadjuk a fenti aktivált észtert. A kapott rcakciókcvcrékct 14 órán át 4°C-on keverjük, miközben a pH értékét 8,5-cs értéken tartjuk 1 n nátrium-hidroxid adagolásával. Az oldatot a fentiek szerint gél-szúrjtik, a konjugátumot tartalmazó frakciókat egyesítjük, ulíraccnírifugálással betöményítjük, sterilizáljuk és a fehérjetartalmat a I«wry és az alkaloidtartalmat radioaktivitásmérésscl meghatározzuk. A kapott konjugátum 9,3 mól vinblasztint tartalmaz l mól galaktozilált humán albuminra vonatkoztatva. A HPLC analízis 91,5% monomer, 7% dimeres 1,5% polimer konjugátumot mutat ki. A fentiek szerint nyert konjugátum lizozim enzimekkel szembeni cllcnállóképességct 5 mmól cisztcin, 40 mmól acélát puffer cs lizozim enzim jelenlétében vizsgáljuk 48 órán át való, 37°C-on végzett inkubálással. A meghatározáshoz aíikvot részt veszünk és40 tf% triklór-ccetsav hozzáadásával kicsapjuk a nem-elbomlott fehérjét, majd 4°C- on tároljuk 1 órán át, centrifugáljuk cs a felüiúszó folyadékrészének radioaktivitását vizsgáljuk. A konjugátum bomlckonyságának mérteke az oldható rész radioaktivitása. A mérések azt mutatták, hogy 24 óra elteltével a konjugátum 75%-a elbomlik cs további változás 48 óráig nem mutatható ki. A fenti példa szerint nyert konjugátum kemoterápiás aktivitását P 388 Leukémia fertózeses nőstény BDF, egereken határoztuk meg: a 0. napon 16r' daganatos sejtet inokuláltunk pcritoneáüsan az egereken, majd a konjugátumot az 1. napon adagoltuk. A vizsgálati eredmények azt mutatták, hogy a konjugátum igen Itatásos, mivel 650%-kai növeli azélctbenmaradási 60 mg/kg dózis esetében és a túlélő egerek száma 60 nap után 5/5. 4. példa Alfa- és gamma N-(4-fí-dczacetil-4-fí-L-N-acedl-hemiaszpariái-vi>iblasztinoil-23)-L-i'iil-íripiofanát Az 1. példa szerint eljárva, N-(dczaccti 1-4-0- vinblasztinoil-23)-L-ctil-triptofanátot-N (4-0-üezacctil-4-O-N-acctiî-hcmiaszpartàt-vinblasztinoil- 23)-tripto-ctii-triptofanáttá alakítjuk (alfa és gamma izomer keveréke). A kapott maradékot kroinatográfiával tisztítjuk (szilikagcl, cter/metanol/ 25%-os ammónium-hidroxid, 50/49, 75/f,25) és 314 g kiindulási anyag esetében 200 mg terméket nyerünk. Tömegspektrum (DCi, accton): H26(M’‘), 1066. 984,970.951.911. IR spektrum (KBr) 3400, 2960, 2940, 1740, 1665, 1618 cm-1. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 30 65 4
