196131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid vakcina előállítására
1 2 A találmány tárgya eljárás olyan E. coli előállítására, amely állatokban influenzavírus fertőzés elleni védelem kiváltására alkalmas fehérje termelésére képes, valamint eljárás a fehérje és az ezt tartalmazd vakcina előállítására. Az influenzavírus fertőzés akut légúti betegségeket okoz emberekben, sertésben, lovakban és szárnyasokban, néha járványos méretekben. Az influenzavírusok ortomixovírusok és mint ilyenek, 80—120 nanométer átmérőjű, beburkolt virionokkal rendelkeznek, két különböző glükoprotein „tüské”-vel. Három típus, A, B és C fertőzi az embereket. Az A típusú vírus felelős a humán járványok többségéért a modern történelemben, bár vannak elszórt kitörései a B típusú fertőzéseknek is. Az ismert sertés, ló és szárnyas vírusoknak mjnd van A típusuk. Az A típusú vírusok hemagglutinin (HA) és neuramidináz (NA) felületi glikoproteinjeikre alapozott antigén-tulajdonságaik alapján három altípusra oszlanak. Az A típuson belül a Hl altípus (sertés-influenza), H2 (ázsiai influenza) és H3 (honkongi influenza) a túlnyomóak az emberi fertőzésekben. A genetikai szóródás (drift) következtében, amely mintegy éves intervallumokban hat a HA és NA fehérjékben levő antigén determinánsokra, nem volt eddig lehetséges „univerzális” influenza vírus vakcinát készíteni a hagyományos elölt vagy legyengített vírusokat alkalmazva, vagyis olyan vakcinát, amely nem törzs-fajlagos. Mostanában kísérleteket folytatnak ilyen univerzális, vagy fél-univerzális vakcinák készítésére különböző törzsek keresztezésével készített több tulajdonságú törzsekből. A legutóbbi időkben az ilyen kísérletek magukban foglalják a rekombináns DNS technikákat is, ezek a kísérletek elsősorban a Hl fehérjére irányulnak. Winter és munkatársai [Nature, 292, 72-75 (1981)] beszámolnak egy A/PR/8/34 törzs (HlNI) HA-ját kódoló DNS szekvenciáról. Ennek a törzsnek a HA1 és HA2 alegységei aminosav- és nukleotid szekvenciáinak százalékos homológiáját összehasonlítják a H2, H3 és H7 alegységeket tartalmazó reprezentatív törzseinek nukleotid- és aminosav-szekvenciáival. Baez és munkatársai [Nucl. Acids Res. 8, 584,5— —5857 (1980)] beszámolnak az A/PR/8/34 törzs nem-strukturális (NS) fehérjéjét kódoló DNS szekvenciáról. Young és munkatársai az A/PR/8/34 törzsből eredő, mind a nyolc RNS szegmensből származó cDNS klónozásáról számolnak be E. coli-ban, valamint az NS1 fehérje magasszíntű kifejeződéséről számolnak be E coli-ban [az Origin of Pandemic Influenza Viruses (A járványos influenza-vírusok eredete) című kiadványban (1983), szerkesztő: W. G. Laver, kiadó: Elsevier Publishing Co., valamint Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80 6105-6109 (1983)]. Emtage és munkatársai a 4.357.421. lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban bemutatja egy Hl influenza vírus gén kódoló szekvencia klónozását és kifejlődését, és bemutatja, hogy a HA polipeptid egy olyan antigén, amelyet vakcinaként be lehet adni. A Morbidity and Mortality Weekly Report 33(*9) 253—261, cikke összefoglalja a legújabb megelőzési és ellenőrzési stratégiát az influenza vírusokhoz, beleértve a dózis- és beadagolási előírásokat a HA fehérjét tartalmazó humán vakcinákhoz. Davis és munkatársai [Gene, 21,273-284 (1983)] beszámolnak a HA-eredetű polipeptidekre adott immunválaszról egerekben. További irodalmi helyek is számolnak be az A/PR/8/34 és más' törzsek HA, NS és más influenza vírus génjeinek klónozásáról és kifejeződéséről. Ilyen irodalmi helyek közül néhányat az alábbiakban még idézni fogunk. Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány lényegét. A találmány egy részről egy olyan vakcina előállításával foglalkozik, amely a védekezést stimulálja állatokban influenzavírusok által okozott fertőzések ellen, ez a vakcina egy HA fehéijétől eltérő polipeptidet tartalmaz, amely rendelkezik a HA fehérje HA2 alegységének egy immunogén determinánsával. A találmány más részről egy polipeptid előállításával foglalkozik, amely a HA fehérjétől eltérő, és amely tartalmazza a HA2 alegység immunogén determinánsát, és amelyet a találmány szerint előállított vakcinában alkalmazni lehet.A találmány ilyen irányú megközelítésének egyik előnyös megvalósulása a C13- nak nevezett fehérje előállítása. A találmány megint más részről egy DNS molekula előállításával foglalkozik, amely a jelen találmány szerinti, vakcina-alapanyagként szolgáló polipeptidhez tarozó kódoló szekvenciát tartalmazza, ide beleértve az egyedülálló kódoló szekvenciát, vagy ugyanezt nagyobb molekulába beleépítve, pl. egy DNS klónozó vagy kifejeződő vektorba. A találmány keretébe tartozik azoknak a mikroorganizmusoknak vagy sejteknek az előállítása, amelyek ilyen DNS molekulákkal vannak transzformálva. A továbbiakban részletesen ismertetjük a találmányt. Az immunogén determinánsok gyakran nem stimulálnak immunprotektív választ. Ez, úgy hisszük, nagyrészt annak tulajdonítható, hogy a determináns a gazdaszervezet védekező rendszerében nem megfelelő konfigurációban van jelen. Amint az alábbiakban majd bemutatjuk és teljes mértékben leírjuk, a HA fehérje HA2 alegységének immunogén determinánsa (amely tartalmazhat egy vagy több összefüggő vagy elkülönült haptént), meglepő módon, egy citotoxíkus T sejt választ indukál különböző törzsek ellen az eredeti altípuson belül, így a HA2 immunogén determináns kiválthat védő immunválaszt, ha ez olyan immunogén konfigurációban van jelen, amely altípus-fajlagos és nem törzsfajlagos. így pl. a HA2 determinánst HA2 alegységet tartalmazó vakcina-polipeptidként lehet bevezetni, ahol lényegében a HA fehérje teljes HA2 alegysége egy második polipeptidhez van kapcsolva, amely lehetővé teszi az immunválaszt az immunogén determinánsba, a HA2 alegységet megfelelő konfigurációjúvá alakítva. Előnyösen az a polipeptid, amely lehetővé teszi az ilyen immunválaszt a HA2 immunogén determinánsra, olyan aminosav-szekvenciát tartalmaz, amelyet egy rekombináns prokarióta vagy eukarióta gazdaszervezet magas szinten fejez ki, hozzákapcsolva lényegében a teljes HA2 alegység N-terminálisához. Különösen előnyös egy olyan polipeptid, amely egy influenza vírus fehérjéből származik. Ez a vakcina-alapanyagul szolgáló polipeptid nem a HA fehérje, 196.131 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
