196131. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid vakcina előállítására
1 2 mivel az immunprotektiv válasz a HA fehérje ellen törzsfajlagosnak látszik. Az ilyen, HA2 immunogén determinánst hordozó vakcina-polipeptid kifejeződésénél E. coli ban előnyös, ha az a polipeptid, amely lehetővé tesz egy immun-választ a HA2 determinánsra, az NS1 influenza vírus fehérje N-terminálisa. Ennek egyik tényleges és előnyös kiviteli formája az a fehérje, amelyet itt Cl 3- nak nevezünk. A C13 fehérje az NS1 fehérje első 81 aminosavához HA1 eredetű szerinen és argininen át hozzákapcsolva a teljes HA2 alegységgel rendelkezik. A találmány szerinti vakcina-polipeptidet kémiai szintézis útján elő lehet állítani. Előnyös azonban az ismert rekombináns technikákkal előállítani, a polipeptidet kódoló szekvenciát hordozó DNS fregmens klónozásával és kifejeződésével E coli gazda-mikroorganizmuson belül. E. coli gazdaszervezetet nagy mennyiségű kívánt fehérje biztonságos és olcsó előállítására lehet alkalmazni. A HA2-t, NSl-et és az influenza-vírus más fehérjéit kódoló szekvenciákat szintetikusan lehet előállítani, vagy vírus DNS-ből lehet kialakítani ismert technikákkal, vagy a rendelkezésre álló cDNS-tartabnú plazmidokból lehet előállítani. így pl. a fentebb idézett irodalmi hivatkozásokon kívül egy HA-t kódoló DNS szekvenciát az A/Japan/305/57 törzsből klónoztak, és szekvencia-;,analízisnek vetettek alá Gething és munkatársai, amint erről beszámoltak a következő irodalmi helyen: Nature, 87, 201—306 (1980). Az A/NT/60/68 törzshöz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Sleigh és munkatársai, valamint Both és munkatársai, amint erről mindkét munkacsoport beszámolt a Developments in Cell Biology című kiadványban (kiadó: Elsevier Science Publishing Co. 1980), a 69-79., illetve 81-89. oldalon. Az A/WSN/33 törzshöz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Davis és munkatársai, valamint Hiti és munkatársai, amint erről a következő irodalmi helyeken beszámoltak: Gene, 10, 205—218 (1980), illetve Virology, 111, 113—124 (1981). Szárnyas pestis vírushoz tartozó HA kódoló szekvenciát klónoztak Porter és munkatársai, valamint emtage és munkatársai, amint erről mindkét munkacsoport beszámolt a Developments in Cell Biology című kiadványban (lásd fentebb), a 39-49., illetve 157—168. oldalon. Influenzavírusok, beleértve egyéb törzseket, altípusokat és típusokat, rendelkezésre állnak klinikai mintákból és a köz számára nyitott deponáló helyekről, ilyen pl. az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok. A vakcina-polipeptidek klónozásához és kifejeződéséhez szolgáló rendszerek különböző mikroorganizmusokban és sejtekben, pl. E. coli-ban, Bacillus-ban, Streptomyces-ben, Saccharomyces-ben, emlős- és rovarsejtekben ismertek és rendelkezésre állnak magán- és állami laboratóriumokban és letéti helyeken, és kereskedelmi eladóknál. A találmány szerinti vakcina tartalmaz egy vagy több találmány szerinti vakcina-polipeptidet, és egy hozzá tartozó hordozót vagy hígítót. így pl. egy ilyen vakcina tartalmazhatja lényegében a teljes HA2 alegységet a különböző altípusok mindegyikéből, mindegyiket az NS1 fehérje N-terminális aminosavaihoz fuzionálva, ezek nagy mértékben konzervált állapotban vannak normál fiziológiás sóoldatban vagy más fiziológiás oldatban. Adjuváns, pl. alumínium-hidroxid, hasznosnak bizonyulhat. Egy előnyös vakcina magában foglalhat három vakcina-polipeptidet, amelyek mindegyike tartalmazza lényegében a teljes HA2 alegységet a Hl, H2 és H3 altípusok egyikéből, bármilyen NS1 fehérje első 80 aminosavához fuzionálva, mint a C13 fehérje esetében. Egy másik módszer szerint polivalens vakcinát lehet készíteni a találmány szerinti egy vagy több polipéptidből, kombinálva influenza vírusból vagy más patogénekből származó további immunogénekkel, mint pl. alegység- vagy polipeptid antigének vagy elölt vírusok vagy baktériumok, így olyan vakcinát álh'tva elő, amely védelmet stimulálhat influenza vírus ellen, valamint más támadó organizmusok vagy vírusok ellen. Az ilyen vakcinák kiszerelési technikái ismertek. így pl. a vakcina-polipeptidet, és más immunogéneket kombinált vakcinák esetében, Iiofitezni lehet ezt követő rehidrálás céljaira fiziológiás sóoldatban vagy más fiziológiás oldatban. Az adagolási és beadási műveleteket a standard vakcinálási gyakorlattal összhangban lehet optimalizálni. Tipikusan a vakcinát intramuszkulárisan adjuk be, bár a beadás más útjait is lehet alkalmazni, mint pl. orális, szemen belüli vagy orron belüli beadást. Arra alapozva, amelyet más polipeptid vakcinákról ismerünk, várható, hogy egy hasznos egyszeri adagolás felnőtt embernek 1,5—150 mikrogramm, előnyösen 10-10 mikrogramm közti tartományban van. A vakcinát kezdetben késő nyáron vagy kora ősszel lehet beadni, és újabb adagot lehet beadni 2-6 héttel később, ha szükséges, vagy időszakonként is lehet beadni, mint immunitás-szintentartót, pl. minden 2-5 évben. Az itt következő példák csak a bemutatás célját szolgálják, és nem céljuk a találmány oltalmi körének korlátozása. 1. példa pM30 plazmid A pAPR701 plazmid egy pBR322 eredetű klónozó vektor, amely hordozza az Ml és M2 influenza vírus fehéijék kódoló területeit (A/PR/8/34). Ezt Young és munkatársai írták le a „The Origin of Pandemic Influenza Viruses” (A járványos influenzavírusok eredete) című kiadványban (szerkesztő: W. G. Laver, kiadó: Elsevier Science Publishing Co. 1983.). A pAPR 801 plazmud pBR322 eredetű klónozó vektor, amely az NS1 kódoló területet (A/PR/8/34) hordozza. Ezt Young és munkatársai írták le a fentebb idézett munkájukban. A pASl plazmid pBR322-eredetű kifejeződő vektor, amely tartalmazza a PL promotort, egy N hasznosító helyet (hogy csökkentse az átírási polaritási hatásokat az N fehérje jelenlétében) és a CII riboszóma kötőhelyet, beleértve a cll transzlációs iniciációs kodont, amelyet közvetlenül egy BamHI hely követ. Ezt Rosenberg és társai írták le: Methods Enzymol. 101, 123-138(1983). A pASldeltaEH plazmidot a pBR322 origó egy nem esszenciális EcoRI-HindlII területének kiiktatásával nyerjük pASl-ből. A pAPR 801 1236 bázis-, páros BamHI fragmensét, amely tartalmazza az NS1 kódoló területet a vírus eredetű 861 bázispáron be196.131 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
