195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
6 195857 7 son nátrium—dodecjl-szulfát (poliakrilamid) gélen (SDS-PAGE) végzett eiektroforézis után. A fentiek szerint tisz.titoLl peplidil-glicin cc-amidáló monooxigenázt alkalmazzuk a találmány szerinti eljárásoknál egy terminális glic.in-gyökkel rendelkező polipeptid nlfnkarbonil csoportjának amidálására, ahol a glicin úgy működik, mint aminor.soport-átadó. A szubsztrátuin pepiidet vagy polipeptidet természetes forrásokból lehet tisztítani, vagy alkotó aminosavból szintetizálni, vagy rekombináns DNS technikával előállítani. A glicinnel befejeződő polipeptidet kombináljuk oxigénnel megfelelő mennyiségű enz.im jelenlétében. Az igényelt enzim mennyisége számos változótól függ, amelyek ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak, beleértve (de nemcsak ezekre korlátozva) a következőket: az adott enzimkészítmény fajlagos aktivitása, az átalakítandó szubsztrátum mennyisége és kémiai szerkezete, az idő, amelyen belül az átr alakulás végbemegy, valamint a rekaciókeverék hőmérséklete és pH-ja. Azok, akik a szakterületen jártasak, ismerhetnek más változókat is, amelyek befolyásolhatják az igényelt enzim pontos mennyiségét egy adott helyzetben. Az oxigént általában sztöchiometrikus mennyiségben alkalmazzuk, de az oxigén fölöslege nem befolyásolja a reakciót. A réz-ionok jelenléte is szükséges, és ezt szolgáltathatja bármilyen réz-só, amelynek anionja nem befolyásolja károsan a reakciót. Amikor az enzim mintegy 1 milli-egység/mg fehérje fajlagos aktivitással bír, a maximális or-amidálás 4,7 réz(II)-ion koncentrációnál megy végbe. Ahogy az enzim tisztasága növekszik, a külső réz(TI) ionra való koneentrációigény csökken. Az enzimes aktivitást lehet növelni aszkorbát-íon jelenlétével is, amelyet bármilyen sója szolgáltathat,, amenynyiben a só kationjának nincs káros hatása a reakcióra. Az olyan tisztított enzimnél, amely mintegy 50 milli-egység/mg fehérje fajlagos aktivitással rendelkezik, az oc-amidálás maximális aktivitása mintegy 5,5 mmól/1 aszkorbátnál van. Az cc-amidáló aktivitást lehet növelni kataláz hozzáadásával is. Az <r-amidálásí reakció optimális pH-ja 6,5 és 7,5 között van. A jelen találmány szerinti eljárásnál felhasznált tisztított enzim cc-amidáló aktivitását tisztított enzim cc-amidáló aktivitását úgy demonstráljuk, hogy radioaktív jódozolt D-Tyr-Val-Gly-t alkalmazunk szubsztrátumként, vagyis olyan pepiidet, amelynek szekvenciája utánozza a melanocita stimuláló hormon prekurzor karboxi-terminálisát. A vizsgálatokat 100 mmól/1 TES 1 N-trisz( hidroxi-metill-metil-2-amino-etánszulfonsnv | pufferben hajtjuk végre, pH = 7,0-nál, 37 "C hőmérséklet 3 órán át. A terméket a [l25I] Tyr-Val-NH2-t, kationcserclö kromatogmf iával különítjük el a szubsztrátumtól. Az amidáló enzim aktivitását szintén demonstráljuk, olyan szintetikus szubsztrátumok alkalmazva, amely a kalcitonin karboxi-terminélis szekvenciáját, a lTvr2SGly33] kalcitonin-(26-32)-t utánozza. A találmány részletesebben a következő példákkal illusztráljuk.---- 1. péld a - ; -...... -Eljárás az MTC-daganatokból származó cr-amidáló enzimkészitmény tisztítására Fagyasztott patkány-MTC-daganatokat apró részecskékké poritunk, és 150 mmólos Tris-oldatban (pH = 7,5) homogenizálunk, amely 250 mM szacc.harózt, 0,25 X, N-acetil-glukopiranozidol, 0,lmM PMSF-t, 20 pg/ml pepsztatint és 100 jug/ml szójabab-tripszin-gá'.lót tartalmaz. Általáhan 25 g daganatszövetet homogenizálunk 200 ml fenti pufferelegyben, jéghűtés közben. A homogenizálást négy, egyenként 20 másodperces művelettel érjük el, Polytron homogenizáló berendezésben (Birkmari) 7-es beállítás mellett. A hornogenizátumot 15 percig 9000 x g sebességgel Ja-20 rotorban (Beckman) centrifugáljuk, és a telülúszól (a továbbiakban: Sup.l) dékániéi juk. A centrifugakalácsot ismételten homogenizáljuk 60 ml homogenizáló pufferelegyben, három 20 másodperces műveletben, aminek során a berendezést mindig 7-cs bcáüi • tásban tartjuk. Ezt a második homogenizátuinot ismételten 15 percig 9000 x g sebességgel centrifugáljuk. Ez utóbbi centrifugálásból származó felülúszót (a továbbiakban: Sup.2) koniriáljuk a Sup. 1-vel. Az egyesített Sup. 1 és Sup.2-t 30 percig 100 000 x g sebességgel SW28 rotorban (Beckman) 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk. A deriteti hoinogenizátumhoz (a továbbiakban: Sup..3) annyi ammónium-szulfátot adunk kristályos formában, hogy az oldat 25 % ammónium-szulfátol tartalmazzon. A kristályos sót fokozatosan, állandó keverés közben 15 perc alatt adjuk a 4 °C-on tartott homogenizátumhoz. További 30 perces, 4 °C-on végzett keverés után az elegyít Ja-20 rotorban (Beckman) 4 °C-on 15 percig 27 000 x g sebességgel centrifugáljuk, a felülúszót dekantáljuk, és a felülúszóhoz addig adunk ammónium-szulfátot, amig 40 % ammónium-szulfátot nem tartalmaz. További 30 percig keverjük, majd 15 percig 27 000 x g sebességgel centrifugáljuk. Ez utóbbi műveletből származó felülúszót eldobjuk, és a lepényt, amely a hornogonizátunibari lévő összes enzimaktivitásnak legalább 50 X-át tartalmazza, ismét szuszpendál juk 50 mmólos Tris-IlCb (pH = 7,0) pufferban. így kapjuk a mintát, amelynek aktivitása 8,2 mU/mg fehérje. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
