195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
8 195857 9 2. példa Az enzinikészitmény scjttenyószet felúlúszójából az alábbi módon is elkülöníthetjük: Meghatározott összetételű szövettenyészet-közeget (F10/DMEM) alkalmazunk MTL (CA-77) patkány-daganatsejtek tenyésztésére. Mihelyt a sejtek összefolyása bekövetkezik (a szubkultúrázást követően körülbelül 7-10 nappal), a közeget cseréljük, és minden második napon összegyűjtjük. Ezt a közeget az alábbiakban leírt módon dolgozzuk fel és tisztítjuk az enzinikészitmény előállítása céljából. Használt szövettenycszet-közeget szivattyúzunk egy DEAE anioncserélö töltetre (250 a CUNQ, Inc. cégtől) 25 ml/perc áramlási sebességgel. Az enzimet a töltet megköti, és utána 500 mmólos konyhasóoldattal eluáljuk. Az alfa-amidáló enzimaktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, liofilizáljuk, az igy kapott terméket desztillált vízzel reszuszpendáljuk, és méret-kizárásos kromatográfiónak vetjük alá. E célra Sephaeryl 300 szuperfinoni gyantát használunk (Pharmacia cég, lásd az alábbi 8. fejezetet) Az amidáló enzimkészitmény a tisztasági fokon mentes a nemspecifikus proteoütíkus aktivitástól, és aktivitása legalább 50 mU/mg fehérje. Az e lépésből származó amidáló enzimkészitményt sikeresen alkalmadtól-, rel-'ombipánd. glv-v°) kiegészített humán kalcitonin, valamint növekedési hormont felszabadító faktor amidálására. Ha 1-1,5 x 106 sejt/mt sejtsűrüségről indulunk, akkor rutinszerűen 200-350 mU hozammal kapunk amidáló enzimaktivitást a használt közeg 1 literére számítva, a fenti két tisztítási lépés után. Az enzim stabilis, és alkalmas arra, hogy amidáló reagensként használjuk közvetlen or-amidálására vagy enzim-immobilizálásra. 3. példa Sepharcy] S-300 gélszűrés: méret-kizárásos kromaiográfia Sepharcyl S-300-at (Pharmacia) 50 inraólos Tris-HCL (pH = 7,0) puffereleggyel kiegyensúlyozunk, majd K 50/100 oszlopba öntjük (Pharmacia) a gyártó cég használati utasítása szerint. Az oszlop agytérfogata körülbelül 1,3 liter. Az 1. vagy 2. példa szerint kapott mintát körülbelül az oszlop ágylérfogala 3 %-ának megfelelő mennyiségben viszszük az oszlopra. Az oszlopról a fehérjéket 50 mmólos Tris-HCL oldatta) (pH = 7,0) kb. 2 ml/perc áramlási sebességgel eluáljuk. 10 ml-es frakciókat gyűjtünk, és ezek amidáló enzimaktivitását Dansy]-D-Tyr-Val-G)y-szubsztrálum alkalmazásával megmérjük. Az enzimet az oszlopról eluálva olyan terméket kapunk, amelynek - az 1. ábra szerint - egyetlen aktivitási csúcsa van, amelynek molekulatömege (10 000-65 000 dalion. A termék aktivitása legalább 50 mU/mg fehérje. 4. példa Mono 0 kromaiográfia 6,0 pH értéken: erős anioncserélö kromaiográfia :l"' A Sephaeryl S-300 oszlopról kapott, "maximális enziumktivilásl tartalmazó frakcióval összegyűjtjük, és 4 liter 20 mmólos bisz-Tris puffereleggyel (pH = 6,0) szemben dializéljuk. Az igy kapott terméket Mono Q HR 5/5 oszlopra töltjük (Pharmacia), amelyet előzőleg a gyártó cég használati utasításai szerint előkezeltünk, és 20 mmólos bisz-Tris puffereleggyel (6,0) kiegyensúlyoztunk. Miután az oszlophoz nem kötődő fehérjéket az oszlopról eltávozó eluátumban összegyűjtöttük, az oszlopon megkötött fehérjéket 20 mmólos bisz- Tris pufferoldatban (pH = 6,0) oldott 0-300 mM nétrium-kloriddal a lineáris koncentráció-gradiens elve alapján eluáljuk. Az oszlopon az eluálószerl 0,5 ml/perc áramlási sebességgel vezetjük át, és 2 ml térfogatú frakciókat veszünk. A Mono (? oszlopról 6,0 pH-értéken eluáll fehérjék oldatát rögtön közömbösítjük úgy, hogy olyan csövekbe gyűjtjük, amelyek mindegyike 200 pl 1,0 mólos 7,0 pH-értékű Tris-t tartalmaz. A frakciók oc-amidáio enzimaktivitását a fentebb elmondottak szerint meghatározzuk; a csúcsaktivitást az oszlopról eltávozó azon eluátumban figyelhetjük meg, amelyet kb. 160 mmólos nátrium-klorid oldattal kapunk (lásd a 2. ábrát). Az aktivitás 161 mU/mg fehérje. 5. példa Mono Q kromatográfia. 8,0 pH értéken A 6,0 pH értéken végzett Mono Q kromatogréfiából származó cc-amidáló enzim-csűcsaklivilásl tartalmazó frakciókat két váltással, egyenként 4 liter 50 mmólos Tris-HCL oldattal szemben (pH = 8,0) dializáljuk. Ezután az enzimei 50 mmólos Tris-HCL oldattal (pH = 8,0) kiegyensúlyozott Mono ő HR 5/5 oszlopra (Pharmacia) visszük, a fehérjéket 0-300 mM nátriumkloridot tartalmazó oldatokkal (50 mmólos Tris-HCL oldatban, pH = 8,0) a lineáris koncentráció-gradiens elve szerint eluáljuk. Az áramlási sebesség 0,5 ml/perc, 2 ml térfogatú frakciókat veszünk. Minden egyes frakciót 200 pl 1,0 mólos Tris oldattal (pH = 7,0) semlegesítünk. Ennek során két különböző enzimaktivitásl-csúcs figyelhető meg; az egyiket 190 mmólos, másikat 220 mmólos nátrium-klorid koncentrációval eluáljuk (lásd a 3. ábrát). Az 5 10 15 20 25 10 35 40 45 50 55 60 6
