195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
4 1 9u8 'o 7 szükségól, hogy a glicin amino-csoport donor legyen, más szerzők is igazolták. Landymore, A.E.N. és munkatársai i i'.BKC, 11/ÍU, 289-293(1983)] azt mutatták be, tiogy az alariin is szolgálhat aminocsoport-donorként az amidálási reakcióban. Kizer és munkatársainak ezt kővető munkája tPNAS 81,(3228-3232(1984)] kél különböző enzimaktivitást mutatott ki patkány-agyban, amelyek képesek voltak katalizálni az cc-amidáló aktivitást. A nagyobb molekulatömegül fajtának (70 000 dalion) glicinre korlátozott fajlagossága van a szubszlrélum karboxil-tenninálisánól. A kisebb molekulatümegü enzim elfogad ac-alaninnal, mint karboxil-lerininális aininosavval rendelkező szubsztrátumot. A sertés agyalapi mirigyből kivont és részlegesen tiszti tolt cc-amidáló enzimek pH optimumáról Bradbury A.F. és Smythe, D.G. számoltak be [BÉRC, 112,(2), 372-377(1983)], ezt 7,0-nak találták. Eipper B.A. és munkatársai [PNAS, 80, 5144-5148(1983)] megerősítették ezeket az eredményeket, arról számolva be, hogy patkány agyalapi mirigyekből részlegesen tisztított oc-amidáló enzimek pH optimuma 7. ők azt is megjegyezték, hogy az enzimaktivitás gyorsan csökken 6,5 alatti vagy 7,5 fölötti pH szinten. Az összes fentebb említett közleményben a kivonatok és részben tisztított enzim-keverékek tartalmaztak más proteolitikus enzimeket is, umolyek elbontják a lehetséges szubsztrátumokat és termékeket, valamint az cc-arnidáló enzimet is. A találmány célja, eljárás biztosítása tisztított oc-amidáló enzimek alkalmazásával cc-amidált peptidek előállítására peptid- vagy polipeptid szubsztrátumokból. A találmány tárgya eljárás cc-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására karboxil-terminális glicincsoportot tartalmazó peptidek bői vagy polipeptidekból oly módon, hogy az említett peptideket vagy polipeplideket min. 25 mU/mg fehérje aktivitású (dansyl-D-Tyr-Val-Gly-COOIí dansyl-D-Tyr- Val-CONIh-vé alakításakor 37 °C-on pH = 7- -nél meghatározva) peplidil-glicin-oc-amidáló monooxigenázt tartalmazó tisztított enzimkészílmény jelenlétében - amely lényegében más protealitikus, a kiindulási peptideket vagy polipeplideket, az amidéit peptideket vagy polipeplideket, valamint magát a peplidil-glicin-oc-ainidáló monooxigenázt lebontani képes enzimet tartalmaz, és amely enzimet úgy nyertük, hogy pajzsmirigy velő karcinóma szövetet, pajzsmirigy velő karcinóma sejtvonalat vagy ilyen Bejtvonalakal tartalmazó szövettenyészetek tápközegét anioncserélő kromatográfiának, majd méretkizárásos kromatográfiának, majd az ezeknél kapott peptidil-glicin-oc-amidáló monooxigenázt tartalmazó cluens frakciót erős anioncserélő kromatográfiának vetettük alá - oxidálunk. Felfedeztük, hogy a találmány szerinti eljáráskor szükséges homogénen tisztított ic•l a-amidák') enzimet előállíthatjuk egy többlépcsős eljárás révén, szilárd tumor kivonatokból, tumor sejtvormlakból és az ilyen sejtvonalakból készített szövotlenyószlő tápközegbői végzett kombinált eljárást alkalmazva, a n érd-kizárásos módszert és az ioncserélő króm litográfiát kombinálva. Az enzimet WAG/líij Wislar patkányokon kifejlődött patkány pajzsmirigy velő karcinómábói extraháljuk, amint ezt Koos és munkatársai leírták | Endocrinology, 150,(1), 27--32(1979)]. Ezt a szövetet IVI-10028-kérít helyeztük letétbe. Az enzimet más forrásokból is extraháluk, nevezetesen humán és patkány rajzsmirigy velő karcinóma sejtvonalakból. A 77(74) patkány sejtvonal pajzsmirigy velő karcinóma tumorokból származott passzálósok sorozata után, amint ezt Muszynski, M. és munkatársai leírták [JBC 258, 11678-83(1983)]. Ezt a sejlvomdnl lVI-10029-kcnt definiáltuk. A 1ITT54(34) humán sejtvonalat Koos B.A. fejlesztette ki a VA Medical CeriLer-nél (Cleveland, Ohio), humán pajzsmirigy velő karcinóna sejteket alkalmazva az elsődleges tenyészethez. A HTT 54(34) humán sejtvonalat IVI-10031-kénl helyeztük letétbe. A meghatározott szövellenyéztö tápközegröl - mind a humán, mind a patkány sejtvonalakból - azt mutattuk ki, hogy jelentős oc-ainidáló enzimaktivitás szintet tartalmaz, jelezve, hogy az enzim egy része kiválasz.tódik a sejtből. Az enzimei kinyerjük óh tisztítjuk, a nyersanyagot először anioncseréló kromatográfiának vetve alá. A mintát pl. lehet nagy tömegben terhelni preperalív léptékű anion-cserélö oszlopra, pl. DE-52 gyantára (Whatman Limited). Az tr-amidáló aktivitást tartalmazó terméket azután méretkizárásos kromatográfiának vetjük alá megfelelő szétválasztó képességgel rendelkező gyantán, pl. Sephacryl 5-200 szuperfinom oszlopon, amely' a Pharmacia Pine Chemicals-nál kapható. Az aktivitást tartalmazó eluált frakciókat azután ioncserélő kromatográfiának vetjük alá, erős anioncseréló mátrixot alkalmazva. Egy gy'anta, amit alkalmazhatunk, a Mono Q HR 5/5 erős anioncseréló gyanta a Pharmacia Fine Chemicals-tói; és egy' vagy több ótbocsátáB is szükséges lehet az oszlopon az enzim homogén tisztításához. Mindegyik tisztítási lépést figyelhetjük mind fehérje-tartalom szerint, mind <t-amidá]ó aktivitás szerint. Ezt az információt alkalmazzuk, hogy k iszámitsuk az enzim fajlagos aktivitását, amely az enzim relatív tisztaságának jelzőjeként szolgál. Az igy létrejött enzim peplidil-glicin cc-amidóló monooxigenáz (patkány-eredetű; IV1- -10032; humán eredetű: ÍVJ — 30033), amelynek molekulatömege mintegy 00 000 és 05 0ÜÜ dalion között van. Ez úgy van tisztítva, hogy legalább mintegy 25 nhlli-egység/ing fehérje, előnyösen legalább a0 milli-egység/mg fehérje fajlagos enzimaktivitási mutasson. Ez olyan módon van tisztítva, hogy egyedi, homogén, jól definiált csíkot mutasr> 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 65
