195857. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-amidált peptidek vagy polipeptidek előállítására
2 19u857 -3 A rialiv fehérjék prekurzor formáinak sejten belüli műveleteit (hasítás és/va gy funkcionális csoport módosítás) a kódoló nukleinsav-szekvenciákból való transzlációjukat követően már világosan dokumentálták. Általában az emlős sejtek és más eukariólák végre tudnak hajtani bizonyos transzláció utáni feldolgozási folyamatokat, míg a prokarióták ezt nem tudják elvégezni. Bizonyos prokariótákat, mint pl. E. colit, széles körben alkalmaznak gazdaszervezetként emlős fehérjék előállításához rekombináns DNS (rDN'S) technológia útján, mivel ezeket könynyen lehet növeszteni nagy mennyiséget magában foglaló fermentációs eljárásokban, és mivel ezek genetikailag jól jellemzettek. A genetikai manipulációk révén termelt sok emlős fehérje azonban bizonyos típusú transzláció utáni feldolgozási folyamatokat igényel, és így gyakran kell végezni komplex, in vitro kémiai vagy enzimes folyamatokat, amelyek nagy léptékű termelésben alkalmazva megfizethetetlen költségúek. A feldolgozási folyamat aktivitások egyik típusa egy fehérje karboxi-terminális aminosavának fajlagos amidálása (a -COOH csoport átalakítása -CONH2 csoporttá). Több, természetben előforduló hormon és peptid tartalmaz ilyen módosítást, amely gyakran nélkülözhetetlen, ha a fehérjéknek biológiailag aktívnak kell lennie. Egy példa erre a kalcitonin, ahol egy nem-araidált prolin gyökbe helyettesítése a natív formájú amidéit prolin helyébe a biológiai aktivitás 3000-szeres csökkenését eredményezi. Az az eszköz, amely hal erre a C-lerminális (alfa) amidálásra, egy glicin gyököt ismer fel, amely kötvellenül követi az amidálni kívánt aminosavat (R-X-gly, ahol R a fehérje további része, X az a gyök, amelyet amidálni kívánunk, és gly a glicin gyök). A glicint lehasítjuk és az amino-részl valóban hozzáadjuk az utolsó előtti arninosavhoz, ezáltal amidálva ezt. A peptidek és fehérjék karboxi-lerminálisának amidálására képes enzim-készítményeket különböző forrósokban leírtak. Így pl. Bradbury A.F. és munkatársai [Nature, 298, 68G-G88(1982)] beszámolnak egy «-amidátó enzimes aktivitásról, amely sertés agyalapi mirigyben van jelen. Husain, J. és Tate, S.S. [FEBS Letters, 152(2), 277-281(1983)] olyan oc-amidáló aktivitást Írnak le, amely a szarvasmarha agyalapi mirigy nouroszekréciós granulumaiban van jelen. Kipper és munkatársai [PNAS 80, 5144- -5148(1983)] olyan cí-amidáló enzim-aktivitásról számolnak be, amely a patkány agyalapi mirigy első, középső és hátsó lebenyében van jelen. Gomez és munkatársai [FEBS Letters, 167(1), IGO — 1G-4(1984)] meghatározták, hogy a patkány hipolaíamusz szintén tartalmaz «-amidéi]« enzim aktivitást. Bradbury, A.F. és Smythe, D.G. [Peptides Structure and Function: Proceedings of the light American Peptide Symposium (Peplid-szerkezet és működés: Vili Amerikai Pepiid Szimpózium Közleményei), 249-52(1953), 5 Hruby, V.J. és Rich, D.H. szerkesztésében] leírják u-amidáló enzim-aktivitás jelenlétét patk íny pajzsmirigyek ben. Mains, R.E. és munkatársai [Endocrinology, ILI, 1522-1530(1981)1 beszámolnak arról, lt) hogy egy agyalapi mirigy első lebenyből származó rágcsáló scjlvonal (ATT-2G) oc-amidáló aktivitást tartalmaz, amely nyilvánvalóan csökken a tenyésztés idejének előrehaladtával. ^ Azok a mirigyek és szervek, amelyekről ismert, hogy amidéit peplidekel tartalmaznak olyan enzimet, amely képes katalizálni az amidálási reakciót. így pl. alacsonyabbrendű élelformájú állatokról, ínint a kutyahalról (Sqralus acarithias) leírták O’Donahue, T.C. és munkatársai [Peptides, 3, 353-39511982)), hogy agyalapi mirigy extraktumai amidéit pep'.idckel tartalmaznak. Scheller, R.H. és munkatársai [Cell, 32, 7-22(1983)1 beszámoltak amidáló szignál peptidek jelenlétéről az Apylsia tengeri csigában. Ennek az aktivitásnak a természetben láthatóan mindenütt jelen való elterjedése ellenére kevés információt , publikáltak ennek fizikokemiai jellemzőiről. Ez unnak tulajdonítható, hogy az enzim igen alacsony szinten van jelen ezekben a ricuroendrokrin szervekben. Mindeddig az cc-amidépő enzimek tisztité•1.- sál és jellemzését nőm publikálták. A részlege sori tisztított enzimkészitinéiiyek fiziokémiai tulajdonságairól azonban beszámoltak. Az első szerzők, akik beszámoltak egy hozzávetőleges molekulasúlyról az cc-amidáló 40 enzimekhez, Bradbury, A.F. és munkatársai voltak [Nature, 298, 686-881(1982)]. Sephadex G-100-al alkalmazva mintegy 60 000 dalion minimális látszólagos molekulatömeget feltételeztek. A további tanulmányok arra a következtetésre jutottak, hogy az enzim molekulatömege 60 000 és 70 000 dalion között van. Ilyen tanulmányok pl. a kővetkezők: Húsain, J. és Tate, S.S.: FEBS Letters, 152(2), 277- 50 -2F1-(1983); Kipper, B.A.: PNAS, B.A. kötet, 267(1), 3228-3232(1984); és Kiser, J.S. és munkatársai: PNAS 81, 3228-3232(1984). Kipper és munkatársai [PNAS, 80, 5144- -48(1983)] beszámoltak arról, hogy molckuiá- 55 ris oxigén hozzáadásán kívül két kofák tor is szükséges a maximális enzimaktivitáshoz; ezek: az aszkorbinsav és a réz(ll) ion. A peptid karboxi-lcrminálisának amidálúsát eredményező kémiai reakció egy amino- 60 -csoport forrást is igényel. Bradbury, A.F. és munkatársai [Nature, 298, G8G-6B8(1982) J bemutatták, hogy a glicin elhasad és átadja az amino-részl az utolsóelőtti aminosavriak, ez utóbbi a iniciálását eredményezve. Annak 65 3
