195855. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tumorellenes hatású LL-E33288 jelű antibiotikum-komplex és komponensei előállítására
36 195855 37 8. példa Ll,-E33288cei-J, .o-J és .a-J elválasztása nz LL-E33288m-J, ß2-J és Si-J anyaguktól Kb. 41.3 g nyers LL-E33288 komplexet (amelyet NRRL-I5975 segítségével, szervetlen jódot tartalmazó táptalaj felhasználásával nyert 7500 liter fermentáció feldolgozásával nyertünk az 1. és 2. példa szerinti eljárással két egyenlő részre osztunk és két külön szilikagél-oszlopon (2,5 x 110 cm nyagságú ; Silica Woelm, 32-36 um töltött; etil-acetátlal egyensúlyba hozott) kromat.ografálunk. Az oszlopokat előbb etil-acetáttal 4 órán át 4 ml/perc áthaladási sebességgel eluáljuk, ás 20 tnl-es frakciókat gyűjtünk össze. Az eluálószert ezután konkav gradiens szerint 0. 1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfállal telített etil-acet.áttól 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 10% izoproynl-alkoholt tartalmazó elil-acetátig terjedő oldószer-elegyekre cseréljük le cs 24 órán ót eluáljuk. Az oszlopokat végül 0,1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telített, 10% izopropilalkoholt tartalmazó ctil-acetátta! egy éjszakán át eluáljuk. A frakciókat BIA teszttel megvizsgáljuk és a biológiailag aktiv frakciókat vékonyréteg kromatográfiás úton, a 3. példában leírtak szerint megelemezzük. A két oszlopról nyert, LL-E33288(C3-J tártaiméi frakciókat (86-107. frakció) összegyűjtjük és a fenti módon feldolgozzuk. Kb. 2,1 g nyers LL-E33288.t3-.1-t kapunk. A két oszlopról nyert, LL-E33288íCi-J-t és ct2-J-t tartalmazó frakciókat (182-253. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 4.2 mg nyers keveréket kapunk, amely LL— E33288;a-J-t és ca-J-t tartalmaz. A két oszlopról nyert, LL-E3328852-1-1 és ßi-J-t tartalmazó frakciókat (254-272. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 1.2 nyers LL-E33288/J2-.1-1 és ßi-.l-L tartalmazó keveréket kapunk. Az LL-E33288^í-J-t tartalmazó és a két oszlopról nyert frakciókat (273-302. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 1,9 g 30% tisztaságú LL-E332887i-J-t kapunk. A két oszlopról nyert, l.L-E33288ái-J-t tartalmazó frakciókat (303-340. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 1,3 g részlegesen tisztított LI.-E33288Í í-J-t kapunk. 9. példa 1. L-E33288vt-J tisztitása Kb. 900 mg, a 8. példa szerint nyert, 30% tisztaságú LI.-E33288-ji-.7-l 2,5 x 120 cin nagyságú, 2:2:1 arányú melil-aeetát/diklói—metán/etanol (.'léggyel egyensúlyba hozott Sephadex 1 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografálunk és 12 ml-es frakciókat gyújtunk össze. A frakciókat biológiai aktivitásra meghatározzuk és a fenti módon vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az LL-E332R87i-J-t tartalmazó frakciókat (24-33. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. 428 mg 64%-os tisztaságú I.L-E33288-Ji-,)-t nyerünk. A fenti termék 22 mg-os mintáját 0. 8 x 24 cm nagyságú 55 : 45 arányú acetonotril/0,2 mólos vizes arnmónium-acetát elegygyel egyensúlyba hozott Sepralyte oszlopon 2 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografálunk és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk öszsze. A frakciókat biológiailag aktivitásra meghatározzuk és a fentiekben leírt vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel megelemezzük. A tiszta LL-E33288 ji-J-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és feldolgozzuk. 7,7 g tiszta Ll.-E33288-2i-.I-t kapunk. 1U példa 1.1. -E33288j\-J és J2-J tisztítása Kb. 600 mg a 8. példa szerint előállítón nyers LL-E33288j) 2-J és Ui-J keveréket 2,5 x 120 cm nyagyságú, 2:2:1 arányú elil-ac.etát/ /diklór-metán/etanol eieggyel egyensúlyba hozott Sephadex LII-20 oszlopon 1 ml/perc. álhaladási sebességgel kromatografálunk és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk öszsze. A frakciókat a fentiekben leírt módon biológiai aktivitásra meghatározzuK és vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az 1.L-E33288/J2-J-t és ßi-J-t tartalmazó frakciókat (23-31. frakció) összegyűjtjük és feldolgozzuk. 81 mg részlegesen tisztított LI,-E3288/n-J-t és ßi-J-t tartalmazó keveréket kapunk. A kapott mintát 1,5 x 90 cm nagyságú, 3:1:1 arányú hexán/diklór-metán /elanol eieggyel egyensúlyba hozott Sephadex LH-20 oszlopon 0,8 ml/perc áthaladási sebességgel kromatografáljuk és 12 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat a fentiekben leírt módon biológiai aktivitásra meghatározzuk és vékonyréteg-kromatográfiás elemzésnek vetjük alá. Az LL-E33288ß2-J-t (17-30. frakció) és LL-E33288yj i-J-t (31-38. frakció) tartalmazó frakciókat külön összegyűjtjük és feldolgozzuk. 31 mg részlegesen tisztított LL-E33288/)2-J-t és 20 mg 80% tisztaságú LL-E33288/5í-J-t kapunk. 11. példa 1. L-E33288 komplex laboratóriumi előállítása 1.1. -E33288-UV 784. ÍNRÍÍL-I81l9hból Spórákat és micéliumokat tartalmazó szuszpenziót állítunk elő Micromonospora achinospora ssp. calichensis, LL-E33288-UV 784 (NRRL-18149) ferde tenyészetből úgy, 10 15 20 25 30 35 10 45 50 55 60 65 20
