195855. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tumorellenes hatású LL-E33288 jelű antibiotikum-komplex és komponensei előállítására
38 195855 39 hogy 5-8 ml vizet adunk hozzá és a tenyészet felületét lekaparjuk. A szuszpenzióval beoltunk 50 ml következő összetételű steril közeget: élesztő 0.5% marha extraktum 0.3% triptóz 0.5% dextrin 2.4 % dextróz 0.5% kalcim-karbonát 0.4% víz 100%-ig A fenti 250 ml-es 1 Írjénmexer lombikban lévő táptalajt 28 °C-on rotációs rázóberendezésen inkubáljuk 200 percenkénti fordulatszám mellett 3-4 napig és így kapjuk az 1 fokú inokulumot. Ezzi :.d beoltunk 50 ml ugyanilyen összetételű steril táptalajt 250 ml-es lombiakban 2 napig és így egy II fázisú inokulumot kapunk. A II fázisú oltóanyagot a kővetkező összetételű 100 ml steril f e. r me n tác ió s tápt. a la j beoltására használjuk: szacharóz 2.0% vas-szül fát-he pta-hidrát 0.01% magnézium-szulfát-hepla-hidrát 0.02% kalcium-karboná t 0.25% pepton 0.4% melasz 0.25% kálium-jodid x 0.01% víz 100-ig * bróm analógok előállítására kálium-bromidol használunk. 500 ml-es lombikokban 28-30 °C-on inkubáljuk a fenti táptalajt rotációs rázóberendezésen 250 percenkénti fordulatszám mellett 6 és napig ezalatt összegyűjtjük a fermentlevet. LL-E33288-UV 78-1 alkalmazásával I.L-E3328E komplex nagyüzemi fermentációs előállítása. Egy háromlépcsős inokulumot állítunk elő LL-E33288-UV 78-1 (NRRL-1849) tenyészetből. Az oltóanyag táptalaj összetétele a következő: Komponensek: literenként kalcim-karbonát 4 g Hodags FI) 82 * 1 ml dextrin 24 g glükóz 5 g élesztő extraktum 5 g trip ton 5 g marhaextraktum 3 g víz 1-1-re kiegészítve 1 a Hodag" FD 82 szilikon habzásgálló szer. Az első lépcső 100 ml fenti steril táptalajból áll 500 ml-es lombikba, melyet 32 °-C-on 2 napig inkubálunk 200 percenkénti fordulatszám mellett. Ezt az első terméket használjuk azután n második lépés beoltására, amely 10 1 fenti steril táptalajból áll, melyet 2 napig tenyésztjük 32 °C-on és 450 percenkénti fordulatsz-árn mellett egy kis fermentorban steril légáramlás mellett. A légáramlás az elegy térfogatára vonatkoztatva 1 térfogat levegőt jelent percenként (VVM). Ezt a második fázisban kapott terméket használjuk n harmadik lépés beoltására, amely 2 napig 32 °C-ori 200-250 percenkénti fordulatszám mellett tenyésztett 300 1 steril táptalajból áll. A tenyésztés 0,67 VVM steril levegőáramlás mellett történt tankfermenlorban. A III. lépcsőből 300 litert használunk steril 1500 liter fermentációs táptalaj beoltására, amelynek összetétele a következő: Komponensek: szacharóz 20.0 S vas-szulfát-he p tahi drát 0.1 g m ignézi um-szül fát.-he p tahidról 0.2 g pepton 5.0 g melasz 5.0 g kálium-jodid * 0.5 g k ti lei um-karbonát 5.0 g He. dug* FD 82 5.0 ml tetszés szerinti víz 1 bróm analógok előállitására kálíum-bromidot használunk. A fermentálást 30 °C-on végezzük 0,75 VVM steril levegőáramlás mellett, a hátsó nyomás 5,51 104 Pa és percenként 120 fordulatszámú terelőlapáttal hajtott keverést hajtunk végre 5-6 napig, és ezalatt összegyűjtjük a fermentlevet. 13, példa LL-E33288<m-I, LL-E33288/U-I, LL-E33288-ji--I és LL-E33288Si-I izolálása LL-E33288-UV 784 (NRRI.-18149) fermentációjából 12,4 g LL-E33288U-I és 10,5 g I.L-E?3288ái-I~t tartalmazó 1500 literes adagot alaposan összekeverünk 1500 1 etil-acetáttal 3 óra hosszat, majd szűrési segédanyagot adunk hozzá és az elegyet leszűrjük. A szerves fázist elkülönítjük és 100 1-re koncentráljuk, a pH-t 2n nátriumhidroxid hozzáadásával 6-7-re állítjuk, és a vizes fázist eltávolitjuk. A szerves fázist tovább koncentráljuk 20 1-re és a vizes fázist bármilyen közbenső zsírokat eltávolítjuk. A szerves fázist végül aranyszínű sárga sziruppá koncentráljuk, ezt lassan 7-8-szoros térfogatú gyorsan kevert hexánba öntjük. A hexán oldhatatlan gumiszerű anyag, amely LL-H33288 antibiotikumokat tartalmaz. Ezt elkülönítjük, újra feloldjuk 3 1 etil-acetátban és vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk. A szárított etil-acetát oldatot kis térfogaira koncentráljuk, és éter és hexán hozzáadásával kicsapjuk. 53 g nyers LL-E33288 komplexet kapunk, amely 4,9 g ij-I-t, 2,8 g 5-I-t és kis mennyiségű o-I-t és úi-I-t tartalmaz. í) 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 G0 21
