195855. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a tumorellenes hatású LL-E33288 jelű antibiotikum-komplex és komponensei előállítására
32 195855 33-acetál/metanol eleggyel folytatjuk, 8 órán ót. Az oszlopokat végül 90 : 10 arányú etil -acetát/metanol eleggyol 10 órán át ehiáljuk. A frakciókat módosított biokémiai indukció teszt (B1A) segítségével meghatározzuk. A pozitív reakciót adó frakciókat TLC-nek vetjük alá, előre bevont szilikagél 00 lemezeket felhasználva és az előhívást 0.1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfáttal telitelt, 3 % izopropariolt tartalmazó etil-acel.áttal végezzük el. A detektálás módosított, B1A felhasználásával, bioautográfiával történik. Az LL-E33288cci-Br, («-Br, tC3-Br és <<4- -Br (LL-E33288x-Br komplex) tartalmú frakciókat a három oszlopról összegyűjtünk, szárazra pároljuk, majd a maradékot etil — -acetátban oldjuk és kevés vízzel mossuk. Az etíl-ac.etátos oldatot vízmentes nátrium-szulfát felett szárítjuk és bepároljuk. Kb. 4,2 g nyers LL-E33288oc-Br komplexet kapunk. Az LI,-E33288oC2-Br, pi-Br és 71-Br (7--Br-t tartalmazó LL-E33288/j-Br komplex) tartalmú frakciókat a három oszlopról öszszegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 2.0 g nyers LL-E33288lfl-Br komplexet kapunk, amely 7- -Br-t is tartalmaz. 4. példa LL-E33288/ii-Br és LL-E33288f1-Br izolálása Kb. 1,9 g, a 3. példa szerint előállított, •j-Br-t is tartalmazó LL-E33288a-Br komplexet 90 : 10 arányú metanol-viz eleggyel egyensúlyba hozott, 2 x 10 cm nagyságú Sephadex" LH-20 oszlopon, 1,2 ml/perc áthaladási sebességgel kromatograféljuk és 15 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat BIA segítségével megvizsgáljuk és az aktívnak talált frakciókat a fentiekben ismertetett TLC módszerrel analizáljuk. Az LL-E33288/ii-Br, /52-Br és 71-Br nagy részét tartalmazó 21-26. frakciókat összegyűjtjük és a metanol nagy részét eltávolítva bepároljuk. A kapott vizes elegyet liofolizáljuk. Kb. 435 mg, részben tisztított komplexet kapunk, amely kb. 10% 11-E33288^ i-BR-t, 1% LL-E33288^2-Br-t és 4% LL-E332887i-Br-t tartalmaz. A fenti, részben tisztított LL-E332880- -Br komplexet (amely 7-Br-t is tartalmaz) két egyenlő részre osztjuk és két 1,5 x 100 cm nagyságú, töltött (kovasavgél 60, 40--63 um, EM) és 98 : 2 arányú etil-acetát) metanol eleggyel egyensúlyba hozott szilikagéloszlopon, 1 ml/perc áthaladási sebességgel kromatograféljuk, 12 ml-es frakciókat gyűjtünk össze. A frakciókat a biológiai aktivitásra meghatározzuk és a fentiekben ismertetett TLC analízisnek vetjük alá. A primer módon LL-E33288/) i-Br-t tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, bepároljuk és hexánnat kicsapjuk. 26 mg 80% tisztaságú LL-E33288;} i-Br-t kapunk. Az LL-E33288-J1- -Br-t tartalmazó frakciókat (kromatografálósnál közvetlenül az LL-E332880 i-Br utón jelentkezik) összegyűjtjük és feldolgozzuk. Kb. 4,5 g 30 % tisztaságú LL-E33288>i-Br-t kapunk. Néhány, LL-E33288/j2-Br-t tartalmazó frakciókat (kromalografálásnól közvetlenül az LL-E33288ö í-Br előtt jelentkezik) összegyűjtünk és feldolgozunk. Nyomnyi mennyiségben LI.-E33288/>2-Br-t kapunk. 5. példa l.L-EJ3288di-Br végső tisztítása ■ A 4. példa szerint kapott, kb. 26 mg 80% tisztaságú LL-E33288/>i-Br-t egyéb, hasonló tisztaságú LL-E33288/} í-Br mintákkal egyesítjük, amelyeket azonos körülmények mellett végrehajtott, más fermentációs folyamatoknál nyertünk. Összesen kb. 38 mg egyesítettjii-Br-t fordított fázisú preparatív TLC segítségével tovább tisztítunk; Whatman PLKCieF, előre bevont, 90 : 10 arányú metanol/0.1 mólos pH 4.0 értékű ammónium-acetát puffer eleggyel előhívott TLC lemezeket alkalmazunk. Az LL-E33288/Ji-Br-t tartalmazó sávot [Rí = 0.66; rövidhullómhosBzú (254 nm) UV lámpa alatt a kioltó hatás segítségével láthatóvá téve] kivágjuk és az antibiotikumot az adszorbensről 0.1 mólos vizes kálium-dihidrogén-foszfát-oldattal telitett, 10% izopropilalkoholt. tartalmazó etil-acetáttal lemossuk. Az oldatot bepároljuk, a maradék etil-acetátban oldjuk és kevés vízzel mossuk. Az LL-H33288/) i-Br-t tartalmazó szerves oldatot feldolgozzuk. Kb. 24,5 mg 90%-os tisztaságú LL-E33288ßi-Br-t kapunk. A mintát preparatív TLC segítségével szilikagél (szilikagél GF előre bevont lemezek, 1000 m, Analtech) tisztítjuk, az elöhivást 0.1 mólos vizes kálium-foszfáttal telitett, 3% izopropanol-alkoholt tartalmazó etil-acetáttal végezzük el. A rövidhullámhosszú (254 nm) UV- lámpán mutatott fő kioltó sávot (kromatografólás Rí = 0.7) kivágjuk és az antibiotikumot az adszorbensről 80 : 20 arányú diklór-metán/metanol eleggyel lemossuk. Az LL-E33288ß í-Br-t tartalmazó szerves oldatot feldolgozzuk. Kb. 18,8 g gyakorlatilag tiszta LL-E33288ß í-Br-t kapunk. 6. példa LL-E33288\\l-Br végső tisztítása Kb. 4,5 mg 30% tisztaságú, a 4. példa szerint előállított LL-E33288-ji-Br-t azonos körülmények között végzett más fermentációkból származó, hasonló tisztaságú más LL-E332887i-Br mintákkal egyesitűnk. Összesen 18 mg egyesített mintát preparatív vékonyréteg kromatográfiával szilikagélen (szilikagél 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 65 18
