195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
19 195734 20 Elvégeztük a tisztított gD-1 és gD-2 minták amínosavelemzését. A gD-1 és gD-2 mintákat kimerítően dializáltuk vízzel szemben, majd 6 mólos sósavba helyeztük, és vákuumban, 110 °C hőmérsékleten 24, 48, illetve 72 órán át hevitettük. Az aminosavuk mennyiségi elemzését Dkmex D500 aminosavelemző készülékkel végeztük. A szerin és Lreoniri értékeit úgy számítottuk ki, hogy zérus időpontra extrapoláltunk. Az izoleucin, leucin és valiri mennyiségét a 48-, illetve 72-órás hidrolízis alapján számítottuk. A ciszteint perhangyasuvas oxidáció után határoztuk meg. Az analitikai eredmények, melyeket a 2. táblázatban adunk meg, azt mutatják, hogy a két tisztított glikoproteid teljes összetétele hasonló, de nem azonos. Ez a megfigyelés összhangban van az előzőleg leírt, triptikus peptidelemzésre alapozott feltételezéssel. 2. TÁBLÁZAT Amínosavösszetétel Aminosav Maradékok gD-1 száma egy molekulában* gD-2 Asp 40 35 Trhb 24 23 Serb 46 62 Glu 53 59 Pro 35 27 Gly 47 51 Alá 37 44 Valc 23 20 Met 5 6 Ilec 23 19 Leuc 38 32 Tyr 15 7 Phe 11 5 His 8 11 Lys 16 22 Arg 22 16 Cyst 12 11 Trp nem hatái’oztuk meg nem határoztuk meg ■Feltételeztük, hogy gD-1 esetében az aminosavak összes száma 455 (átlagos molekulasúlyuk 110). Feltételeztük, hogy gD-2 esetében az aminosavak összes száma 450 (átlagos molekulasúlyuk 110). Feltételeztük, hogy a gD-1 molekulasúlya a szénhidrát levonása után 50000. Feltételeztük, hogy a gD-2 molekulasúlya a szénhidrát levonása után 49500. bAz értékeket zérus időpontra extrapoláltuk. cAz eredményeket a 48-, illetve 72-órás hidrolízis átlagértékére alapoztuk. A következő példa a 2. példa szerint tisztított gD-1 és gD-2 immunológiai hatékonyságát mutatja be. 3. példa A 2. példa szerint készített gD-1 és gD-2 biológiai aktivitásának igazolására két eljárást alkalmaztunk. Az első eljárás szerint meghatároztuk, hogy a gl)-1—el és gD-2-vel való immunitálás válaszaként termelt ellenszérum HSV-közömbösitő aktivitását. A második eljárás során megmértük a tisztított gD-1 és gD-2 azon képességét, hogy az előzőleg leírtak szerint előállított CP-1 elleni szérum szérum-közömbösiLő kapacitását gátolja. Figyelemre méltó, hogy - nézetünk szerint - ez a gD-2 esetében az immunológiai hatóképesség első meghatározása. Első eljárásunk során a gD-1 és gD-2 elleni szérumokat a következőképpen állítottuk elő. CAFI egereket (10 hetes nőstények) immunadszorbens segítségével tisztított gD-1-vel és gD-2-vel immunizáltunk. Minden egyes egérnek négy intraperitoneális befecskendezésből álló sorozatban adtuk a megfelelő antigént (a teljes immunizáló adag 7,5 Mg fehérje), melyet a teljes Freund-féle adjuvánsban emulgeáltunk. Az adagolási rend a következő volt: az első befecskendezés 3 pg-t tartalmazott; ezt követte 1,5 pg gD befecskendezése a 7., 21. és 35. napon. A 45. napon az egereket elvéreztettük. A közömbösítési (neutralizációs) titereket az előzőleg leirt plakk-csökkentési (folt— -csökkentési) módszerrel határoztuk meg. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a különböző mértékben hígított ellenszérumot 90 percig 37 °C hőmérsékleten 60 lemez képző egységet tartalmazó vírussal 40 pl végtérfogatban inkubáltuk. Minden egyes keverék felét (azaz 30 p. f. u. vírust) egy 96, BHK sejteket tartalmazó bemélyedéssel kiképzett Costar lemez egyik bemélyedésébe adtuk. Egyórás adszorpciós időszak után a sejteket friss közeggel felülrétegeztük, 24 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, és a plakkokat invertált mikroszkóp alatt megszámláltuk. Közömbösítési titerként a szérum azon legnagyobb hígításának reciprok értékét választottuk, amely 50%-kal csökkentette a titert az immunizálás előtti (preimmun) szérummal összehasonlítva. Az összes egerek monoprecipitin ellenszérumot termeltek, mely típusra vonatkozóan közös módon immunkicsapásos reakcióba lépett a pgD prekurzorral. Ez a megfigyelés a gD-1 és gD-2 tisztaságának további bizonyítéka. A 3. táblázat ■ mutatja, hogy a gD-1 és gD-2 az összes immunizált egérben serkentette a magas titerű, típusra vonatkozóan közös, közömbösítő ellenszérum termelődéséi. E kísérletekből az a következtetés vonható le, hogy mind a gD-1, mind a gD-2 tisztítása biológiailag aktiv formában történt. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 11
