195734. lajstromszámú szabadalom • Eljárás herpes simplex vírus elleni védőanyagok előállítására
21 195734 22 3. TÁBLÁZAT Ellenszérum elnevezése Előállítva egerek ellen (egerek száma) Közömbósitési (neutralizáciÓ6) titer» iISV-1 HSV-2 gD-1 elleni 1 2048 1536 szérum 2 1536 512 3 1536 512 gD-2 elleni 1 192 512 szérum 2 512 1024 3 1024 1024 4 1024 , 1536 5 192 512 »Az eredményeket úgy fejeztük ki, mint a szérum azon legnagyobb hígításának reciprok értékét, amely 50%-kal csökkenti a p. f. m. értékét a megfelelő viras- és immunizálás előtti it-reimmun) egér-szérum-kontrollokkal összehasonlítva (22). A nyúlból származó CP-1 elleni szérumnak a közömbösítési titere 512 volt HSV-l-vel és 25G HSV-2-vel szemben, ha a vizsgálatot azonos mérési rendszerben végeztük. A második, szérumgátló vizsgálat céljára a mintákat a következőképpen készítettük elő. Tisztított gD-1 vagy gD-2 egy alikvot részét (30-50 pg fehérje) módosított lizáló, azaz roncsoló (a továbbiakban: ML) pufferoldatban dializátuk sorrendben NP-40 csökkenő koncentrációval szemben (0,1%, 0,01%, 0,001% és NP-40 nélkül), amelyet 0,01 mólos, 7,5 pH értékű, 0,15 mól nátriuni-kloridot tartalmazó Tris pufferoldatban oldottunk. Minden egyes dializis-lépés után az elegy egy részét kivettük, és kvantitatív RIP méréssel meghatároztuk a radioaktivitást és a kötési aktivitást. Csupán az utolsó dializis-lépésben (azaz amikor NP-40 nem volt jelen) lépett fel jelentős veszteség. E lépésben a triklór-ecetsavval kicsapható radioaktivitásnak mintegy 50%-a hiányzott, a megmaradó 50% HD-l-kötó képességében azonban nem volt szignifikáns csökkenés. A meghatározást egy 96 bemélyedést tartalmazó lemezen, az előzőleg leírt módszer módosításával végeztük. Röviden összefoglalva úgy jártunk el, hogy a gD-1 vagy gD-2 higitásait az ellenszérum meghatározott hígításával elegyítettük. Az ellenszérum hígítását úgy választottuk, hogy ez a hígítás a 60 p. f. u. virus 75 - 90%-át közömbösítette. Az antigén-antitest elcgyet 1 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd minden egyes elegyhez 60 p. f. u. vírust adtunk (40 pl végtérfogatban). Az elegyeket 37 °C-on 90 percig inkubáltuk, majd minden egyes keverék felét egy ?r 96, BHK sejteket tartalmazó bemélyedéssel kiképzett Costar lemez egyik bemélyedésébe adtuk. Egy órás adszorpciós időszak után a sejteket friss közeggel felülrétegeztük, 24 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk, .^g majd a plakkokat invertált mikroszkóp alatt megszámláltuk. Az 50%-os végpont a gD-nek az a hígítása volt, amely a szérum közömbösítő képességét 50%-ban gátolta. Előzőleg kimutattuk, hogy a tisztított .,5 CP-1 antigén serkenti a magas titerű, típusra közös vírusközőmbösítő antitest termelődését. Ha a tisztított gD-1 és gD-2 azonos biológiai hatékonysággal rendelkeznek, akkor képeseknek kell lenniük kombinálódni CP-1 40 elleni szérummal (és ugyanúgy bármely olyan szérummal, amely gD-re irányuló, közömbösítő antitestet tartalmaz), valamint annak közömbösítő képességét gátolni. Előzetes kísérletek azt mutatták, hogy a glikoprotein frakcióban 45 jelen lévő NP-40 különböző mennyiségei mind a vírust, mind a sejteket gátolták. Glikoproteineknek konyhasót tartalmazó, azonban NP-40-et nem tartalmazó Tris pufferoldattal szemben végzett dialízise nem változtatta fo meg jelentősen a kötőképességét, és a készítmények a továbbiakban már nem mutattak gátló hatást. Ennek a műveletnek következtében azonban a fehérjének mintegy 50%-a veszendőbe ment. Minden egyes gD készit- 55 meny szérumgátló képességét megtitráltuk CP-1 elleni szérummal szemben; egy kísérlet eredményeit (a fehérjeveszteségre korrigálva) mutatja a 4. táblázat. Megfigyelhető, hogy mindkét glikoprotein szérumgátló leégő pessége megközelítőleg azonos. E kísérletünk világosan megmutatta, hogy a gD-2 képes volt meggátolni egy heterológ ellenszérum közömbösítését. 12
