195619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-B vírussal szemben orális vakcinák előállítására
5 195 619 6 b) Immunpreápitáció A HBsAg rotavirus iminunprecipitációját a rekombináns adenovítussal fertőzött sejtekben HBsAg elleni egér monoklonális antitesteket vagy nyúl poliklonális aiitiszérumot és protein A Sepliarosc CL4B-Í használva végezzük. c) Rí A A HB,jAg expresszióját egy kereskedelmi forgalomban lévő radioimmunoassay-vc) (Ausria, Abbott Labs.) is vizsgáljuk. A rekombináns adenovirus immunogén természete Enterális bevonatos kapszulában lévő élő, liofilizált rekombináns adenovirus immunogén tulajdonságának vizsgálatára hörcsögnek vagy csimpánznak adjuk be azt (104-105 50 %-os fertőző dózis/tabletta), és vizsgáljuk az antitest-szintet, valamint a provokálással szembeni védelmet. A jelenleg kereskedelmi forgalomban lévő adenovirus vakcina vagy 4. vagy 7. típusú élő, liofilizált adenovírust tartalmaz, inert segédanyagokkal összekeverve, enterális bevonatos tabletta formájában. A tabletta beadása (közelítőleg 104 TC1D50 a vírusból) szelektív gyomor-bél-rendszeri fertőzést eredményez, betegség nélkül. A vakcina biztonságos; a kiváltott fertőzés kizárólag a bél-traktusra korlátozódik, és a vakcina vírus nem adódik át a vakcináit egyedből a környezetében lévő érzékeny egyedeknek. Az immunizálás után 21 nappal a vakcináit egyedek több, mint 95 %-ában megfigyelhető a specifikus antitest megjelenése. A találmány szerinti eljárással előállított új vakcina hepatitis B felületi antigént expresszáló rekombináns adenovírust tartalmaz, és úgy van formálva, és úgy hat, mint a jelenleg forgalomban lévő adenovirus vakcina, azzal az eltéréssel, hogy az adenovírussal szembeni antitest mellett a hepatitis B felületi antigénnel szembeni antitest is képződik. A találmány szerinti eljárással előállított készítmény alkalmazásával a rekombináns vírusból közelítőleg 104 TCIDS0-et, vagy még ennél is lényegesen kevesebb mennyiséget alkalmazva kiváltható a kívánt immunválasz. Az optimális dózis nagysága az alkalmazott rekombináns adenovfrustó! függ, az optimális dózis meghatározása szakember számára nem jelent problémát. Példa Autentikus HBsAg-t expresszáló rekombináns megszerkesztése A találmány szerinti készítményben alkalmazott adenovirus rekombináns szerkesztésének példájaként a HBsAg transzlációs iniciációs kodonjától 26 bázispárral felfelé és a transzlációs terminációs kodontól 131 bázispárral lefelé terjedő régióból álló adw alfajú HBsAg gént az Ad2 fő késői promoteréből származó ellenirányú szekvenciával [+33 — 400 bázispár; Solnick D., Cell, 24, 135-143 (1981)] és az SV40-ből származó egyirányú szekvenciával [2753 — 2516 bázispár; Tooze J. (szerkesztő) Molekular Biology of Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory 801 — 829. oldal (1980)] vesszük közre. A fenti plazmidot p6XH-nak nevezzük, mint azt már említettük. Ezeket a szekvenciákat az egyetlen Xbal helyes pAC plazmidba illesztjük, amely az adenovirus genom bal végén levő EcoR I kötőtől az. Ad5 i 7,0 térkép-koordinátájánál levő Hind 111 helyig terjedő Ad5 DNS-t tartalmazza [Gluzman Y., Reichl H. és Solnick D.: Eukaryotic Viral Vectors (Y. Gluzman szerkesztő) Cold Spring Harbor Laboratories, 187—192. oldal (1982)]. Az új plazmidokat (pACH-2 és pACH-9), amelyek az Ad2 fő késői promoter—HBsAg gén-SV40 jeleket mindkét orientációban tartalmazó kazettával rendelkeznek, Ilind Ill-mal hasítjuk. Mindkettő Hind 111 hasítási termékét kombináljuk az adenovirus AE1 mutánsának 9,1-100 térkép-koordináták közti nagy Xbal fragmensével [Gluzman Y., Reichl H. és Solnick D.: Eukaryotic Viral Vectors (Y. Gluzman szerkesztő), Cold Spring Harbor Laboratories 187 192. oldal (1982)]. A kapott DNS-eleggyel transzfektáljuk [Graham F. L. és van der Eb A J., Virology 52, 456- 467 (1973)] a 293 sejteket [Graham F. L., Smiley J., Russel W. C. és Nairn R., J. Gen. Virol. 36, 59-72 (1977)] és a sejteket a plakk-képződés céljából agarral felülrétegezzük. Közel 10—14 nap múlva leveszünk 54 plakkot, és mindegyikből vírus-készletet készítünk. A kapott vírusokat megvizsgáljuk a HBsAg DNS jelenléte szempontjából, 32P-jelzett HBsAg DNS-mintával való hibridizáció segítségével. A pozitív plakkokat (54. közül 49) ezután egyréteges 293 sejt-kultúrára visszük és a sejt-lizátumokban radioimmunassay-technikával (AUSRIA, Abbott Laboratories, Inc. vagy NML-HßsAg RIA, Nuclear-Medical Laboratories) és a 3sS-jelzett HBsAg immunprecipitációjával, HBsAg-re monoklonális antitestet alkalmazva (anti-a alfaj, Boehringer Mannheim Biochemicals) is vizsgáljuk az autentikus HBsAg expresszióját. A fenti példában olyan Ad2 fő késői promoted alkalmaztunk, amely csak 33 nukleotidot tartalmaz a transzkripciós iniciációs helytől lefelé, tehát az első illeszkedési helyet nem tartalmazza. Ez a promoter az adenovirus fő késői promoter háromrészes vezetőjéből csak az első részt tartalmazza. Azonban más adenovírusokból, közelebbről a 3., 4., 5. vagy 7. típusú adcnovírusokból származó fő késői promoter is alkalmazható, és ezen promoterek teljes, háromrészes vezetője is alkalmazható. A következőkben két olyan bakteriális plazmid — a pHMl éspHM2 — szerkesztését ismertetjük, amelyek az Ad2 fő késői promoteréből és az Ad2 háromrészes vezetőjének 200 bázispárjából a legbaloldalibb 168 bázispárból, és ezt követően a HBsAg génből, majd az SV40 vírus működési- és poliadenilációs jeleiből álló kazettát tartalmazzák. A plazmidokban a kazettát két oldalról olyan adenovírus-szekvenciák veszik közre, hogy a homológ rekombináció alkalmas legyen a kazettának az adenovirális genomba való beillesztésére. A kazettát bal oldalról az Ad5 genom legbaloldalibb 353 bázispárja, jobb oldalról az adenovirus 5, 8 és 15,5 géntérkép-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 05 4
