195619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-B vírussal szemben orális vakcinák előállítására
7 195619 8-koordinátái közötti szakasz veszi közre. A pl IMI plazmid 19 bázispárt tartalmaz az SV40 vírus szekvenciából (5173—5174 SV40 nukleotidok) a HBsAg gén előtt. A pHM2 azonos a pHMl-gyel, azzal az eltéréssel, hogy az utóbbi nem tartalmazza ezt a szekvenciát. A pHMl és pHM2-ből származó fenti kazettákat az 5. típusú adenovirus genonrjának El régiójába illesztjük, a fentebb ismertetett homológ rekombinációs módszer alkalmazásával. Mindkét plazmidot linearizáljuk és az adenovirus AE1 mutánsának 9,1 — 100 géntérkép-koordináták közé eső, nagy Xbal fragmensével kombináljuk [Gluzman Y., Reich! H és Solnick D.: Eukaryotic Viral Vectors (Y. Gluzman szerkesztő), Cold Spring Harbor Laboratories, 187— 192. oldal (1982)]. A plakkokat leszedjük és mindegyikből vírus-készletet állítunk elő. Ha az így kapott vírusokkal (HM1 és HM2) megfertőzünk egy humán embrionális vese scjtvonalat (293) [Graham F. L., Smiley J., Russell W. C. és Nairn R., J. Gen. Virol. 36, 59-72 (1977)], azt tapasztaljuk, hogy a fertőzés után 40 órával közel 1 jug HBsAg mutatható ki 5 X 106 fertőzött sejtenként a HM2-fertőzött sejtek tenyészetének felülúszójában, radioimmun vizsgálattal, az NML-HBsAg készlet pozitív kontrolljával összehasonlítva a cpm-ct. HM1 vírussal a fenti mennyiségnek közel 60%-a képződik. Vizsgálataink szerint a fenti vírusok által termelt HBsAg polipeptidek glükozilált (P2) és nemglükozilált (Pl) formában vannak [Marion P. L., j Salazar F. H., Alexander J. J. és Robinson W., J. Virol. : 32, 796-802 (1979); Peterson D. L., J. Bioi Chem. , 256, 6975-6983 (1981)]. A fertőzés után 40 órával a HBsAg többsége (78 %-a) részecske formájában (sűrűsége 1.20 g/ml) kiválasztódik a sejtekből a tápközegbe, és azonos, vagy közel azonos az emberi szérumban észlelt 22 nm-es részecskével [Gerin J. L., Purcell R. H., Hoggan M. D., Holland P. V. és Chanock R. M., J. Virol. 4, 763-768 (1969); Gerin J. L., Holland P. V. és Purcell R. H., J. Virol. 7, 569-576 (1971)]. A HM2 köze! 40%-kal több HBsAg-t eredményez, mint a HM1. Azonban a HM2-t a korábban ismertetett hibrid adenovirus AElH-hoz hasonlítva, a HBsAg polipeptid 70-szeres növekedését észleljük a HM2 vírus esetén. Az adenovirális fő késői promoter helyett bármely más megfelelő eukariotikus promotert, például humán metallotionein promotert vagy humán dihidrofoiát reduktáz promotert is használhatunk. Ezenkívül, példáinkban 5. típusú adenovirus DNS-t használtunk vektorként az idegen gén expressziójára; azonban más típusú adenovírusok is használhatók vektorként, különösen használhatók a 3., 4., és a jelenlegi vakcinákban alkalmazóit 7. típusú adenovírusok. Ezenkívül, noha példáinkban az SV40 DNS-ből származó működési és poliadcnilációs jelek használatát Ismertettük, más megfelelő működési és poliadcnilációs jeleket is használhatunk, amelyek adenovirus DNS-ből, különösen a 3., 4. vagy 7. típusú adenovírusokból származhatnak. A találmány szerinti eljárással előállított készítmények alkalmazásakor, amelyekben az idegen gént az adenovirus törölt korai 3. régiójába illesztjük, a rckombináns vírus fertőzőképcs marad, és a vakcinálás csupán annyiból áll, hogy a rekombináns vírust a bélbe juttatjuk. Másrészről, a korai 1. régió szükséges az adenovirus fertőzőképességéhez. Ezért, ha az idegen gént a törölt 1. korai régióba illesztjük, egyidejűleg kisegítő-vírust is kell adagolnunk. Kisegítő vírusként célszerűen módosítatlan, fertőzőképes adenovírust alkalmazunk. A kisegítő vírus azonban lehet maga is egy hiányos vírus, olyan törléssel, amely a rekornbináns vírussal kiegészíthető. Ily módon vírusszaporodás és idegen antigén-képződés csak a mindkét vírussal fertőzött sejtekben mehet végbe. A fenti fertőzőképes kisegítő-vírus a rekombináns vírussal azonos, vagy attól eltérő alfajba tartozhat. Eltérő típus esetén (például, ha a rekombináns vírus az Ad4 altípusba, a fertőző vírus az Ad7 altípusba tartozik), a rekombináció útján történő vad típusú vírus keletkezését a lehető legkisebb mértékre kell csökkenteni. A vakcina előállítása céljából a vírus szaporítását vagy úgy valósítjuk meg, hogy a két vírust együtt tenyésztjük humán diploid fibroblaszton, vagy a vírusokat külön-külön tenyésztjük olyan sejtvonalakban, amelyekről ismert, hogy pótolni tudják a hiányokat. Az El és E3 régiókon kívül számos olyan más régiója is van a virális gcnomnnk, ahova a promoterből, három részes vezetőből, idegen génből és működési és poliadcnilációs jelekből álló kazetta beilleszthető. Ilyen régió többek között az Ela és Elb közötti régió, a genom bal és jobb végén lévő és az E4 régió, és az L5 és E4 közötti régió. Példaként az alábbiakat említjük. Az Ad5 az 1,4 térkép-koordinátánál egy Ela promotert és a 4,7 térkép-koordinátánál egy Elb promotert tartalmaz. Az Ela poliadenilációs helye a 4,6 térkép-koordinátánál az 1631. nukleotid, az 1671. nukleotidná! van a TATA box az Elb promoter számára. Az 1572. nukleotidnál van az egyetlen Hpal hely (GTTAAC). Ezt a helyet lehet használni a 2. típusú adenovirus fő késői promoterének és a hepatitis B felületi antigénjének elhelyezésére és az Ela poliadenilációs hely használatára. Az Ela poliadenilációja az SV40 vírus DNS-ből vagy a vírus L4 régiójából származó poliadenilációs jelnek az Ela mögé helyezésével biztosítható. A fenti módon szerkesztett genomban a pótlólagos DNS-t azáltal kompenzálhatjuk, hogy az E3 régióból eltávolítjuk a nem létfontosságúnak ítélt DNS-í. Más illesztési pontok a genom bal és jobb végén vannak. A bal végen a helyzet a fordított terminális ismétlés 116. bázispárja és az E4 promoter TATA boxa között lesz. Az Ad2-ben a 99,3 térkép-egységnél egy Mbo II hely van. Ez 191 bázispárnyira van a virális DNS jobb végétől. Az Ad5-ben egy Thal(FnU4DII) hely van 240 bázispárnyira a genom bal végétől. Ez a régió az ITR és az E4 TATA box elleniránya között helyezkedik cl. Szükség esetén az extra DNS elhelyezésére E3-törölt mutánsba is illeszthető a DNS. Minden esetben használhatók ugyanezek a régiók illesztési pontként az adenovirus fő késői promoteréből, a háromrészes vezetőből, idegen génből és működési és poliadenilációs jelekből álló kazetta beillesztésére a jelenleg forgalomban lévő adenovirus vakcinák-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
