195619. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hepatitis-B vírussal szemben orális vakcinák előállítására
3 195 619 4 ratories, (1982)]. A beépíthető idegen DNS maximális hosszúságának biztosítására a virális genomból törölhető két nélkülözhető régió, az adenovirus 5. típusú virális genomjának a korai 1. régiója (El) vagy a korai 3. régiója (E3), vagy mindkettő. A AEl-ct egy plazmid és egy módosított adcnovírus-DNS közötti in vivo rekombinációs folyamattal állíthatjuk elő. (A leírásban ismertetett összes plazmidot E. coliban szaporítjuk.) A plazmidot úgy állítjuk elő, hogy az adcnovírus-DNS 0 és 17 géntérkép-egységek közé eső szekvenciáit a pBR322-be illesztjük, majd ezt követően restrikciós endonukleázos emésztést és kapcsolást alkalmazva töröljük az 1,4 és 9,1 géntérkép-egységek közötti szekvenciát és egy Xbal restrikciós helyet illesztünk be erre a helyre. Az így kapott plazmidot pAC-nak jelölik a szakirodalomban. A 4,0 géntérkép-koordinátánál egy egyszerű Xbal restrikciós helyet tartalmazó módosított adcnovínis-DNS-t az alábbiak szerint állítjuk elő. Az Xbal négy helyen hasítja a vad típusú Ad5 DNS-t: a 4, 29, 79 és 85 géntér kép-egységeknél. A 29, 79 és 85 helyeket nem tartalmazó módosított DNS-t úgy izoláljuk, hogy az Ad5 DNS-t Xbal-lal hasítjuk, a DNS-t transzfektáljuk és a 29 és/vagy 79 helyzetben Xbal helyeket nélkülöző módosított adenovírust izoláljuk. A fenti eljárást megismételjük, ily módon olyan módosított adenovírust izolálunk, amely csak a 4 helyzetben tartalmaz Xbal helyet. Ilyen módosított adenovírusokat oligonukleotid-irányított mutagenezis módszert alkalmazva is egyszerűen szerkeszthetünk [Smith M. és Gillam S.: Genetic Engineering, Sctlow J. K. és Hollander A. szerkesztők, 3. kötet 1—32. oldal, Plenum, New York, (1982)]. E módszer szerint az Xbal restrikciós helyeket kémiailag szintetizált oligonukleotidokkal semmisítjük meg, amelyeket úgy terveztünk, hogy a megfelelő Xbal restrikciós endonukleáz helyek által meghatározott aminosavakat kódoló régiókban néma változásokat hozzanak létre. A AE3 vektort az E3 régiószekvencia törlésével szerkesztjük meg. A fenti eljárással két módosított adenovírust (5. típus) állítunk elő. Az egyik nem tartalmaz Xbal helyeket, a másik csak a 29, 79 és 85 géntérkép-koordinátáknál tartalmaz Xbal helyeket. Az Xbal helyeket egyáltalán nem tartalmazó mutáns DNS-énck bal felét a csak 79 és 85 Xbal helyeket tartalmazó mutáns DNS-ének jobb felével egyesítve olyan módosított adenovírust nyerünk, amely csak a 79 és 85 géntérkép-koordinátáknál tartalmaz Xbal helyeket. Az így kapott DNS-t Xbal-lal hasítva, majd újrakapcsolva olyan AE3 vírus-DNS-t kapunk, amelyből a 79 és 85 géntérkép-koordináták közé eső E3 régió törölve van, és helyébe egy egyszerű Xbal klónozó hely van beépítve. A AE1AE3 vektort hasonló módon állíthatjuk elő, mindkét régió törlésével. Az 5. típusú adenovirus AE1, AE3 és AE1AE3 vektorainak előállításához hasonló módon megszerkeszthetjük a 4. és 7. típusú adenovírusok vektorait is. Például a 7. típusú adenovírusban az E3 régiót a 80,5 géntérkép-koordinátánál lévő Xbal hely és a 85 koordinátánál lévő EcoRl hely között töröljük. 6X sorozatba tartozó plazmidok (HBsAg és VP7 rotavirus számára) Szerkeszthetők olyan piazmidok, amelyekkel a hepatitis B felületi antigént kódoló DNS-ből az adenovirus 2 késői promoter ellenirányú szála, majd az SV40 kapcsoló jelek beépíthetők. Ezek mindegyikét Xbal helyek határolják, az adenovirus AE1, AE3 vagy AE1E3 vektorokba való beépülés biztosítására. a) p6XH A 6XH plazmid az Ad2 fő késői promoterjének —400. bázispárjánál egy Xbal-kötőt tartalmaz, és az első adenovirus késői vezetőjének vége előtt 8 bázispárral, a + 33 bázispárnál egy EcoRl helyet tartalmaz. Ezt egy EcoRl kötő követi, a HBsAg ATG-jét megelőző 26. bázispárnál, majd egy 678 bázispárból álló lllisAg szekvencia követi, a 809. bázispárnál lévő másik EcoRl kötőig. Ezt követi az SV40 géntérképen a 2753-tól 2516. bázispárig terjedő SV40 szekvencia. Ezek a szekvenciák mind Xbal kötők segítségével illeszkednek a pBR 322 nagy Bam Hl — EcoRl fragmensébe. c) Plazmid szekvencia bevitele a virális DNS vektorba és rekombináns adenovirus előállítása A promoter-idegen gén-terminátor kazetta adenovírusba való bevitelét vagy az alábbiak szerint végezzük. vagy in vivo rekombinációs módszert alkalmazunk (lásd alább a részletes példát). A tisztított adenovirus vektor DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítjuk, majd borjúból lúgos foszfatázzal kezeljük az ön-kötődés megakadályozására. A plazmidból származó szekvenciákat a p6XH Xbal-lal való hasításával kapjuk. Ezeket azután az adenovirus vektor DNS-hez kötjük. Ezután vagy 293 sejteket [Graham és munkatársai, Gen. Virol., 86, 10 (1978)], HeLa sejteket, /agy Wi38 sejteket transzfektálunk a ligációs eleggyel, is agarral felülrétegezzük. 7—10 nap múlva a plakkokat kiválogatjuk és vírusraktárt készítünk. Expressziós vizsgálatok A hepatitis B felületi antigén kifejeződésének megállapítására háromféle vizsgálatot végzünk, az alábbiak szerint. a) Indirekt immunfluoreszcencia A HBsAg-t DNS-szekvenciát tartalmazó rekombináns AEI és AE3 vírus-készlet expressziójának kimutatására vagy egér mouoklonális antitesteket vagy nyúl antiszérumot használunk. Az ellenfestést kecske anti-egér vagy anti-nyúl FITC-vel végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
