195538. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunstimuláns hatású acil-glikoproteinek előállítására klebsiella pneumoniae sejtekből
1 195 5 38 2 A találmány tárgya új eljárás immunstimuláns hatású acil-glükoproteinek előállítására, Klebsielle pneumoniae sejtek extraktumából. A 2 490 496 számú francia, és a 0 049 182 számú európai szabadalmi bejelentésekből ismertek az új immunstimuláns hatású glükoproteinek, melyeket Klebsiella pneumoniae tenyészetből nyernek. A fenti glükoproteinekre jellemző, hogy 30-40% proteint, 30-40% semleges szénhidrátot, 4%-nál kevesebb glükuronsavat, és 2—5% ozamint tartalmaznak, és molekulatömegük közel 350 000 g/mól. A fenti glükoproteinek további jellemzője, hogy a protein-frakció közel 30% savas aminosavat tartalmaz; a poliszacharid-frakcióban a glükóz és galaktóz mólaránya közel 1:4, és alapvetően az(l) képletíi poliszacharid egységek ismétlődéséből áll. t(3 galaktóz1 galaktóz1 —4 glükóz1 ]n (1) Az (1) képletben m értéke 3,4 vagy 5. A fenti szabadalmi leírásokban ismertetik az eljárást is a fenti glükoproteinek előállítására. A fenti eljárás lényege, hogy a Klebsiella pneumoniae sejtek lizátumának extraktumából diafiltráció segítségével nyert glükoprotein-oldatot kvaterner aminóniumvegyülettel kezelik, a kapott csapadékot elválasztják, a felülúszót - amely a glükoproteinek sós oldatából áll — lehűtik és kis molekulatömegű alkanollal kezelik, a kapott csapadékot vízben oldják, dializálják, liofilczik, majd r'ijra oldatba viszik, és gélszűrik. Az elsőként eluálódó frakciót koncentrálják és kívánt esetben szárítják. A 2 043 475 számú francia szabadalmi leírásban ismertetett eljárás szerint a fenti glükoproteineket dializátor alkalmazásával állítják elő. Az így kapott frakció azonban nem elég tiszta. A fenti szabadalmi bejelentésekben ismertetik a fenti glükoproteinek immunstimuláns hatását, és gyógyszerkészítmények hatóanyagaként történő gyógyászati felhasználásukat is. A fenti bejelentések megtétele után végzett vizsgálatok segítségével felderítettük a fenti glükoproteinek szerkezetét. A glükoproteinek közelebbről acil-glíikoproteinek, amelyeknek poliszacharid-lánca a protein-lánc aszparagin maradékához egy heptózból és 2-keto-3-dezoxi-oktonátból álló magon keresztül kapcsolódik, amely után 0-hidroxi-mirisztinsavat tartalmazó savas rész, majd N-acetil-glükózamin következik. A vizsgálatok továbbá megerősítették a fenti glükoproteinek antiallergiás hatását is. A találmány lényegét az a felismerés képezi, hogy a gazdaságossági követelményeket előtérbe helyezve az eljárás iparilag alkalmazhatóvá tehető oly módon, hogy a kvaterner ammóniumsóval végzett kicsapás, és a csapadék eltávolítása után kapott felülúszót koncentráljuk. A fenti koncentrálást előnyösen olyan eszközökkel végezzük, amelyek szelektív penneabilitásuk következtében alkalmasak a molekulák szétválasztására, ilyen eszköz például az ultraszűrő. A fenti eszközök használatának egyik előnye, hogy az eljárás további részében kisebb térfogatokkal kell dolgozni; másik, meglepő előnyük, hogy alkalmazásuk révén az ismert eljárás későbbi szakaszában igényelt dialízis és gélszűrés elhagyható. A találmány szerinti eljárás tehát a 2 490 496 és a 2 Ó43 475 számú francia, és a 0 049 183 számú európai szabadalmi bejelentésben ismertetett eljárásokkal összehasonlítva új. A glükoproteineket úgy állítjuk elő, hogy a Klebsiella pneumoniae sejtek lizátumának extraktumából diafiltrációval nyert, tisztított glükoprotein-oldatot kvaterner ammóniuin-halogcniddel kezeljük, á kapott csapadék eltávolítása után visszamaradó felülúszót pedig a találmány értelmében egy, vagy több ultraszűrőből álló eszköz segítségével koncentráljuk, a koncentrátumot hűtés után legalább egy kis molekulatömegű alkanollal kezeljük, a kapott csapadékot elválasztjuk, kívánt esetben legalább egy kis molekulatömegű alkanollal mossuk, majd szárítjuk. A találmány szerinti eljárás meglepő módon sokkal hatékonyabb, mint a 2 490 496 számú francia, és 0 049 183 számú európai szabadalmi bejelentésből ismert eljárások, mivel segítségével két időigényes és költséges művelet elhagyható, ezenkívül a kicsapáshoz szükséges alkanol mennyisége is kisebb. A 2 043 475 számú francia szabadalmi leírásban ismertetett eljáráshoz képest pedig sokkal specifikusabb frakció nyerhető a találmány szerinti eljárással. A koncentrálást a molekulák elválasztására használt szokásos módszerekkel végezhetjük, közelebbről szelektív permeabilitású membránokat — nevezetesen ultraszűrőket — használunk. A szelektív permeabilitású membránok különfélék lehetnek. Használhatunk ccllulóz-acetát - például HF-U (Dow Chemicals), HF-U (Kalle Chemie), SEPA-CA (Osmonics) vagy SM (Sartorius) - típusú membránokat; komplex polielektrolitalapú — például UM (Amicon) vagy IRIS 3042 (Rhone- Poulcnc) — membránokat; poliszulfon-alapú — például HIOP (Amicon and Romicon), SEPA PS (Osmonics) vagy IRIS 3022 (Rhonc-Poulenc) — membránokat, poliamid-alapú — például BM vagy BHF (Berghof) — membránokat; aromás polimer-alapú — például PM, MX vagy HF (Amicon and Romicon) — membránokat; vinilklorid—acril-nitril kopolimer-alapú membránokat; helyettesített poliolefin-alapú membránokat; vagy egyéb poliszulfon vagy polietilén hordozóra vitt összetett membránokat, például PT (Millipore) membránt. A fenti membránok lap- vagy csőaíakúak lehetnek, továbbá üreges szálak vagy spirálok formájában is készülhetnek. A glükoproteineket tiszta formában akkor kapjuk, ha olyan ultraszűrőket használunk, amelyeknek áteresztési küszöbértéke 5000 és 100 000 g/mól közötti relatív molekulatömeg-tartományban változik. A találmány szerinti eljárásban előnyösen üreges szálnak kiképzett ultraszűrőt használunk, közelebbről poliszulfon-alapú ultraszűrőt, amelynek áteresztési küszöbértéke 5000 g/mól. A fentieknek megfelelően előnyösen használhatók a H10P5 típusú, Amicon and Romicon cég által gyártott membránok. A koncentrálási műveletet előnyösen szobahőmérséklet közelében, például 20 és 30 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A műveletet a membránt gyártó cég által ajánlott módon végezzük. Tetszés szerint egyetlen membránt, vagy több különböző membránt használunk, és a koncentrálási műveletet egyetlen lépésben, vagy több egymást követő lépésben végezhetjük, folyamatos vagy szakaszos üzemeléssel. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
