195537. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin-származékok előállítására
1 195 537 2 oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik 1%-os vizes D-glükonsav vagy D-laktobionsav oldatban. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az Rf = 0,21. 1 H—NMR: A 2. ábra mutatja a vegyület tömegspektrográfiás felvételét. A vegyület abszorpciós spektruma a) 235 (4,72), 254 (SCH 4,48), 290 (4,04), 495 (4,20) b) 235 (4,73), 254 (SCH 4,48), 290 (4,06), 494 (4,24) c) 244(4,61), 268(4,63) - 570(4,22) 601 (4,19) C6oH84N2O20 molekulatömeg 1152 (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás). Citorhodin V esetében az (I) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Rod és R2 jelentése -Roa-Rod-Acu. 5. példa A citorhodin P és D előállítása 25 mg citorhodin B-t [a (II) általános képletben R3 jelentése -Roa-Rod-Rod és R4 jelentése -Roa-dF-CinA] feloldottuk 3 ml 90%-os etanolban és összekevertük 20 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral, és a citorhodin B 37°C-on 2,5 ml Streptoinyces purpurascens (DSM 2658)ből előállított sejtmembrán szuszpcnzióval (0,5 g/rnt) végzett keverés (150 ford/perc) közben oxidálódott. A HPLC-vel kapott eredmények szerint 24 óra elteltével a kiindulási vegyületből még 21 % nem alakult át, és a képződött citorhodin P és citorhodin D vegyületek aránya 5 :1. A termékkeveréket a 3. és a 4. példa szerint elválasztottuk a reakcióoldatból, preparatív HPLC-vel elkülönítettük és a terméket tiszta formában előállítottuk. Az eljárással megkaptuk a tiszta citorhodin D (0,7 mg) és a tiszta citorhodin P (1,9 mg) vegyületeket, és az átalakulatlan citorhodin B (1,2 mg) vegyületet. Citorhodin P: piros, amorf, anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik a D-glükonsav, vagy a D-laktobionsav 0,1 %-os vizes oldatában. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az Rf = = 0,27. 'H—NMR: A 3. ábra mutatja a vegyület tömegspektrográfiás felvételét. A vegyület abszorpciós spektruma: a) 235 (4,63), 254 (SCH 4,33), 293 (3,90), 494 (4,13) b) 235 (4,60), 254 (SCH 4,31), 293 (3,85), 494 (4,12) c) 244(4,33) - 570(3,59) 620 (3,71) CôoHuîNîOîj molekulatömeg 1164 (FAB-tömegspektrográffal történt meghatározás). A citorhodin P esetében az (I) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Acu és R2 jelentése -Roa-dF-CinA. A citorhodin D esetében az (I) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Acu és R2 jelentése -Roa-dF = CinB. 6. példa 1-hidroxi-Citorhodin U és 1-hidroxi-Citorhodin B előállítása 50 mg 1-hidroxi-citorhodin N [a (II) általános képletü vegyület képletében R3 jelentése Roa-dF-Rod és R4 jelentése Roa-Rod-Rod] és 1-hidroxi-citorhodin 0[a(II) általános képletű vegyület képletében R3 jelentése -Roa-Rod-Rod és R4 jelentése -Roa-dF-Rod] 1:1 arányú elegyet feloldottuk 3 ml 96 %-os etanolban, majd feltöltöttük 30 ml 5,5 pH-jú citrát NaOH pufferral és összekevertük 2 ml Str. galilaeus törzsből készített oxidoreduktázzal (1,6 U/ml) 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulaton. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük: szilikagél oszlopon (Lichrosorb Si 60, 7 p (Merck), kloroform : metanol : 96 %-os ecetsav : víz : trictil-amin 80:10:10:2:0,01 összetételű clucnssel, az áramlási sebesség 0,5-1,5 ml/min volt. A detektálás 495 nm hullámhosszon történt átfolyásos fotométerrel. Tizenhét óra elteltével a kiindulási vegyületeket már nem lehetett kimutatni és a képződött 1-hidroxi-citorhodin B és 1-hidroxi-citorhodin U vegyületek aránya 3 :6 volt. A reakcióoldatot összekevertük 200 pl, 0,1 mól/1 EDTA oldattal, majd az oldat pH-ját 1 n NaOH oldattal 7,5-re beállítottuk és 3X extraháltuk 10-10 ml etilacetáttal. Az etil-acetátos fázist Na2S04-tal víztelenitettük, majd a szárítószert eltávolítottuk és az, oldatot óvatosan vákuumban bepároltuk. A maradékot (45 mg) feloldottuk az előbbiekben megadott fázisban és kromatografáltuk szilikagél oszlopon, amelyet 35 g Lichrosorb Si 60, 7 p (Merck) szilikagéliel töltöttünk meg, az acéloszlop 16X250 mm-es méretű, az áramlási sebesség pedig 10 ml/min volt. Az analitikai HPLC-vel kapott frakciókat (2—2 ml) összeöntöttük, vákuumban bepároltuk, a maradékot 4 ml 3,5 pH-jú Na-acetát oldatban feloldottuk. Az oldatot összekevertük 0,1 ml 1 nimól/1 EDTA oldattal, és toluollal zsír és lágyítószer mentesre mostuk, az oldat pH ját 7,5-re állítottuk be 1 n NaOH oldattal, és a piros terméket metilén-kloriddal extraháltuk. A szokásos Na2S04-os víztelenítés után és a vákuumban végzett bcpárlás után megkapjuk a tiszta 1-hidroxi-citorhodin U-t (3,5 mg) és a tiszta 1 -hidroxi-citorhodin B-t (2 mg). I-hidroxi-citorhodin U és 1-hidroxi-citorhodin B: Piros-lila színű amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik D-glükonsav vagy D-laktobionsav 1 %-os vizes oldatában. Rétegkromatográfia: szilikagél kész réteglap 60 F254 (Merck); oldószer-rendszer : kloroform : metanol : 96 %-os ecetsav :víz 80 10 :10 :2; az Rf érték 0,25 (1-hidroxi-citorhodin U) és Rf = 0,18 (1-hidroxi-citorhodin B). 1-hidroxi-citorhodin U: Abszorpciós spektrum: a) 240 (4,63), 296 (3,82), 523 (4,12), 550 (4,10), 562(4,11) b) 240 (4,64), 296 (3,80), 522 (4,20), 550 (4,15), 562(4,16) c) 243 (4,70), 270 (SCH), 590 (4,23), 635 (4,30) (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás). C60H84N2O22 molekulatömeg: 1184. Az 1-hidroxi-citorhodin U esetében az (I) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Rod és R2 jelentése -Roa-dF = CinB. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
