195537. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás antraciklin-származékok előállítására
1 195 537 2 1-hidroxi-citorhodin B: Abszorpciós spektrum: a) 259 (4,42), 290 (3,66), 522 (3,95), 549 (3,82), 562(3,85) b) 238 (4,45), 298 (3,57), 522 (4,03), 549 (3,91), 562 (3,93) c) 244 (4,41), 280(3,62), 590(3,93), 632(4,01) (FAB-tömegspektrográffal történt a meghatározás). C60H86N2O22 molekulatömeg: 1186-Az 1-hidroxi-citorhodin B esetében az (I) általános képletben R1 jelentése -Roa-Rod-Rod és R2 jelentése -Roa-dF-CinA. 7. példa Az 1-hidroxi-citorhodin P és az 1-hidroxi-citorhodin D előállítása 25 mg 1-hidroxi-citorhodin B-t [a (II) képlet« vegyület képletében R3 jelentése -Roa-Rod-Rod és R4 jelentése -Roa-dF-CinA] feloldjuk 3 ml 90%-os etanolban, és összekevertük 20 ml 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferral, és 37 °C hőmérsékleten 2,5 ml Streptomyces purpurascens (DSM 2658) (2. példa) törzsből készített sejtmembrán szuszpenzióval keverés közben (150 ford/perc) oxidáltuk. A HPLC eredményei alapján 24 óra elteltével még kb. 22% kiindulási vegyület nem alakult át, és a keletkezett citorhodin P és citorhodin D vegyületek aránya 4,5 : 1 volt. A termék keveréket a 3—6. példákban leírtak szerint választottuk el a reakcióoldatból, majd preparativ HPLC- vel elkülönítettük és a terméket tiszta formában előállítottuk. Az eljárással megkaptuk a tiszta 1-hidroxi-citorhodin D (0,9 mg) citorhodin P (3,2 mg) vegyületeket, és az átalakulatlan citorhodin B (1,5 mg) vegyületet. 1-hidroxi-citorhodin P és -D: Lila színű, amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban, oldódik G-glükonsav vagy D- laktobionsav 1 %-os vizes oldatában. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiával az Rf érték 0,27 (1-hidroxi-citorhodin P) és 0,35 (1-hidroxi-citorhodin D). 1-hidroxi-citorhodin P: Abszorpciós spektrum: a) 238 (4,58), 292 (3,77), 522 (4,03), 549 (3,92) b) 237 (4,63), 296 (3,77), 522 (4,17), 549 (4,03), 561 (4,03) c) 243 (4,65), 275 (3,85), 590 (4,11), 632 (4,17) CeoH82N2022 molekulatömeg: 1182. FAB-tömcgspektrográffal történt a meghatározás. 8. példa 1-hidroxi-citorhodin V előállítása 50 mg 1-hidroxi-citqrhodin A-t [a (II) általános képletű vegyület képletében R3 és R4 jelentése -Roa- Rod-Rod] mint D-giükonátot (37 mg 1-hidroxi-citorhodin A szabad bázisnak felel meg) feloldottunk 40 ml í 5,5 pH-jú citrát-NaOH pufferban és 2 ml Streptomyces galilacus törzsből készített oxidoreduktáz oldat hozzáadása után kevertük az clegyet 37 °C hőmérsékleten 150 ford/perc fordulattal. Az átalakítást HPLC-vel ellenőriztük. 48 óra elteltével a kiindulási vegyület 35%-a átalakult. A reakció oldatot összekevertük 0,2 mi (0,1 mmól/1) EDTA oldattal, az. elegy pH-ját 7,5-re állítottuk be 1 n NaOH oldattal, és háromszor extraháltuk 30—30 ml etil-acetáttal. Az elválasztott szerves fázist Na2S04-tal víztelenítettük, és óvatosan bepároltuk csökkentett nyomáson. A maradékot (35 mg) a 3. példa szerint feloldottuk az eluensben és preparativ HPLC-vel elválasztottuk. A 32-47. frakciók az átalakulási terméket tartalmazták, a 88—110. frakciók pedig az átalakulatlan kiindulási anyagot. Az átalakulási terméket a 3. példa szerint zsír- és lágyitószer mentesre mostuk és amorf piros porként elválasztottuk (2,0 mg). 1-hidroxi-citorhodin V: Piros-lila színű amorf anyag, könnyen oldódik metanolban, etil-acetátban, kloroformban, és toluolban, oldhatatlan vízben és hexánban; oldódik D-glükonsav vagy D-laktobionsav 1 %-os vizes oldatában. A 4. példa szerinti rétegkromatográfiás vizsgálat szerint az Rf=0,21. Abszorpciós spektrum: a) 237 (4,54), 295 (3,72), 522 (4,03), 548 (4,86), 561 (3,68) b) 237(4,57), 295 (3,79), 522(4,10), 548 (3,93), 561 (3,93)-) 244 (4,46), 280 (3,76) 590 (3,99), 630 (4,04) C60H88NjC>2i molekulatömeg: 1168. FAB-tömegspektrográfiával történt a meghatározás. Az itt felsorolt példákban a komponensek meghatározása a következő mérési módszerrel történt: A protonok rezonancia spektrumát (! H—NMR- spektrumok) 270 MHZ-en egy HX-270 BRUKER típusú Fourier transzformációs magrezonancia spektrográffal vettük fel. A koncentráció 2—4 mg/0,5 ml volt a 99,8%-os CDC!3-ban; az oldatokat a készítés után rögtön összeráztuk 0,1 ml 5%-osNa2C03-nak 99,5 %-os D20-ban készített oldatával. Az ábrákban csillaggal megjelölt csúcsok a kismolekulájú szennyeződésektől, és az oldószcrmaradékoktól származnak. A tömegspektrumokat MS-902 S AEI típusú tömegspektrográffal mértük FAB (Fast-Atom-Bornbardment)ionforrás felhasználásával. A triglicerides közegben lévő anyagokat az ionforrásba helyeztük, apránként ammónium-kloridot adtunk hozzá. Az abszorpciós spektrumokat a következő oldatban mértük 200-700 nm hullámhossz-tartományban: n) víz-metanol 1 :9 b) 10 %-os metanolos i n MCI c) 10 %-os metanolos 1 n NaOH Az anyag koncentrációja 10—30 mg/1 volt. Megadtuk nm-ben az abszorpciós maximumokat és a moláris extinkciós koefficienst (log e). A citotoxikus aktivitás meghatározása A találmány szerinti vegyületek citosztatikus hatásának a meghatározását L 1210 egér leukémiás sejteken 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
