195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
I 195 534 2 A találmány tárgya eljárás polipeptid előállítására baktériumokban, valamely kódolt szerkezeti gén képzése útján. A dezoxiribonukleinsav (DNS) rekombinációs eljárások létrehozásával lehetővé vált igen sokféle hasznos polipeptid bakteriális úton történő szabályozott termelése. Már rendelkezésre állnak olyan, DNS-rckombinációs eljárásokkal módosított baktériumok, amelyekkel például a következő poüpeptidek állíthatók elő. szomatosztatin [K. Itakura és munkatársai, Science, 198. 1056 (1977)], az emberi inzulin A és B komponense [D. V. Goeddel és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76, 106 (1979)] és az emberi- növekedési hormon [D. V. Goeddel és munkatársai. Nature, 281, 544 (1979)]. Újabban DNS-rekombinációs eljárással állították elő bakteriális úton a csecsemőmirigy által termelt, immunitást biztosító timozin alfa 1 anyagot [Roberto Créa és Ronald Wetzel, amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, bejelentési napja 1980. február 28., illetve a megfelelő 035 454 sz. közzétett európai szabadalmi bejelentés]. A DNS-rekombinációs eljárásokkal gyakorlatilag bármelyik értékes polipeptid előállítható bakteriális úton, és ez elérhető közelségbe hozza hormonok, enzimek, antitestek és sokféle betegség elleni vakcina szabályozott gyártását. A leírásban szereplő hivatkozások utalnak azokra az irodalmi helyekre, amelyek részletesebben ismertetik a fenti példákat. A DNS-rekombinációs eljárások középpontjában a plazmid áll, amely a baktériumokban található DNS kettős spirál nem-kromoszóma része. A plazmid gyakran több példányban is jelen van a baktériumsejtben. A plazmidban kódolt információra van szükség a plazmid újabb sejtekben történő reprodukálásához és általában egy vagy több olyan kiválasztási jellemzőnek, például az antibiotikumokkal szembeni ellenállóképességének az átadásához, amelyek biztosítják, hogy a szóbanforgó plazmidot tartalmazó eredeti sejt kiónjainak növekedése előnyben részesüljön a szelektív táptalajon. A bakteriális plazmidok hasznosíthatósága azon alapul, hogy specifikus módon hasíthatok egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal (vagy restrikciós enzimmel). Az egyes restrikciós enzimek a plazmid DNS különböző helyeire „emlékeznek”, és így eltérő helyeken hasítják azt. A létrejövő heterelóg gének vagy géntöredékek beilleszthetők a plazmidba úgy, hogy a végükkel kapcsolódnak a hasítási helyhez vagy az azzal szomszédos újjáalakult véghez. A leírásban használt „heterológ” kifejezés olyan génre vonatkozik, amely általában nem található meg az Escherichia coli baktériumban, vagy olyan polipeptid szekvenciára, amelyet rendszerint nem termel az Escherichia coli. Ezzel szemben a „homológ” kifejezés olyan génre vagy polipeptidre vonatkozik, amelyet vad típusú Escherichia coli hoz létre. A dezoxiribonukleinsav-rekombináció a baktériumokon kívül megy végbe, azonban a létrejövő „rekomblnált” plazmid bevihető a baktériumokba a transzformációnak nevezett eljárással, és nagy mennyiségben nyerhető heterológ gént tartalmazó rekombinált plazmid a transzformációval létrehozott baktériumok szaporí tásával. Továbbá, ha megfelelően történt a gén beillesztése a plazmid azon részeihez képest, amelyek a DNS-ben kódolt információ átírását (transcription) és lefordítását (translation) szabályozzák, akkor a kapott közeg felhasználható annak a polipeptid szekvenciának a tényleges termelésére, amelyet a beillesztett gén kódol. Ezt a folyamatot kifejezésnek is nevezik. A polipeptid előállítása (kifejezése) a promotor néven ismert tartományban indul be, amelyet a ribonukleinsav (RNS) polimeráz ismer fel és kötődik hozzá. Egyes esetekben, például a későbbiek folyamán ismertetésre kerülő triptofán (trp) operon esetében, a promotor tartományokat átfedik az operátor tartományok, és így kombinált promotor-operátor jön létre. Az operátorok olyan DNS-szek"endák, amelyeket felismerik az úgynevezett visszatartó fehérjék, amelyek arra szolgálnak, hogy szabályozzák az átírás beindulásának gyakoriságát egy bizonyos promotornál. A polimeráz enzim végighalad a DNS mentén.és átírja a kódolt spirálágban az 5’ végétől a 3' végéig tárolt információt RNS-vá, amely átalakul a DNS által kódolt aminosav-szekvenciájú polipeptiddé. Minden egyes aminosavat egy nukleotid triplett vagy „kódon” kódol azon belül, amelyet a szabadalmi leírás céljaira szerkezeti génnek nevezhetünk. Ez az a rész, amely a létrehozott termék aminosav-szekvenciáját kódolja. A promotorhoz történő kötődés után az RNS polimeráz először átírja azokat a nukleotidokat, amelyek egy riboszóma kötési helyet kódolnak, majd a lefordítás kiváltása vagy „startjel” következik [ez rendszerint ATG (adenin-timin-guanin), amely a létrejövő üzenethordozó RNS-ban AUG-vé alakul], azután pedig a nukleotid kódonok jönnek létre magában a szerkezeti génben. Úgynevezett megállító kódonok kerülnek a szerkezeti gén végére, amelyek után a polimeráz további üzenethordozó RNS szekvenciát hozhat létre. Ezt a megállító jel miatt a riboszómák nem fordítják le. A riboszómák az üzenethordozó ribonukleinsavon (mRNS) található kötési helyhez kapcsolódnak, és létrehozzák a kódolt polipeptidet, a lefordítás startjelétől kezdve a fentebb említett megállító jelig. A kívánt termék akkor képződik, ha a riboszóma kötési helyét kódoló szekvenciák megfelelően helyezkednek el az AUG indító kódonhoz képest, és ha valamennyi többi kódon követi fázisban az indító kódont. A képződő terméket úgy különítik el, hogy az eredeti sejtet elroncsolják és megfelelő tisztítást alkalmaznak a többi baktériumfehéije eltávolítására. A DNS-rekombinációs eljárással előállított polipeptid lehet teljesen heterológ, például az emberi növekedési hormon közvetlen előállításakor, vagy tartalmazhat egy heterológ polipeptidet, amelyhez egy homológ pepiid aminosav-szekvenciájának legalább egy része kapcsolódik, mint például a szomatosztatin közbenső termékeinek és az emberi inzulin komponenseinek előállításakor. Az utóbbi esetben a heterológ polipeptidhez kapcsolt homológ polipeptid a béta-galaktozidáz aminosav-szekvenciájának egy részét tartalmazza. Az előállítani kívánt bioaktív terméket biológiai szempontból maktiválja a hozzákapcsolt homológ poli peptid, mindaddig, amíg ez utóbbit le nem hasítják sejten kívüli környezetben. Lehetséges a prekurzor fehéije rendkívül specifikus lehasílása az előállítani kívánt tet-5 10 15 20 25 30 36 40 45 50 55 60 65 2
