195534. lajstromszámú szabadalom • Eljárás polipeptid előállítására bakteriális úton, triptofán promotor-operátor alkalmazásával
195 534 mékből, például metionin brómciánnal történő reagáltatásával vagy enzimes hasítással. [Például 2 007 676A sz. publikált nagy-britanniai szabadalmi bejelentés.] Ha a DNS-rekombinációs eljárás teljes mértékben beváltja a reményeket, akkor olyan rendszereket kell létrehozni, amelyek optimalizálják a beillesztendő gének előállítását, úgy, hogy a kívánt polipeptid termékeket jó termeléssel lehessen előállítani. Az eddig leggyakrabban használt béta-laktamáz és laktóz promotor-operátor rendszerek — jóllehet beváltak — nem használták ki teljes mértékben az eljárás kapacitását a kitermelés szempontjából. Szükség van olyan bakteriális hordozóra, amely képes a kívánt polipeptid termékek jó hozammal való, szabályozott termelésére. A triptofán aminosav, amelyet baktériumok termelnek homológ polipeptidek bioszintézise során a következő úton: korizminsav -» antranilsav ->• foszforibozilantranilsav -»■ CDRP [enol-l-(o-karboxi-fenil-amino)-ldezoxi-D-ribulóz-5-foszfát] -> indol-3-glicerin-foszfát -* -+ triptofán. A fenti enzimes reakciókat a triptofán operon (trp operon) termékei katalizálják. A trp operón policisztron DNA-szegmens, amelynek átírása a trp promotor-operátor rendszer irányításával történik. A létrejövő policisztron üzenethordozó RNS kódolja az úgynevezett trp vezető szekvenciát, majd pedig sorrendben a következő jelzésű polipeptideket: trp E, trp D, trp C, trp B és trp A. Ezek a polipeptidek különféleképpen katalizálják és szabályozzák az egyes lépéseket a korizminsavtriptofán bioszintézisnél. A vad típusú Escherichia coli baktériumban a triptofán operon legalább három különböző módon van szabályozva. Promotor-operátor visszatartás (represszió) esetén a triptofán társ-visszatartókat (korepresszor) hat és a másik visszatartó tényezőhöz (aporepresszor) kapcsolódik. Az így létrejövő aktív visszatartó komplex megköti az operátort, és teljesen lezárja a bioszintézist. Másodszor, visszacsatolást gátló folyamatban a triptofán a trp E és trp D polipeptidekből álló komplexhez kötődik, és megakadályozza a bioszintézisben való részvételét. Végül, szabályozást biztosít a csillapítás néven ismert folyamat is, amelynél a gén „csillapító tartománya” szabályoz. Ez a tartomány a trp vezető szekvenciáján belül helyezkedik el. [Lásd ezzel kapcsolatban G. F. Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 133, 1457 (1978); The Operon, 263—302, Cold Spring Harbor Laboratory (1978), kiadó Miller és Reznikoff; F. Lee és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 4365 (1977) és K. Bertrand és munkatársai, J. Moi. Biol., 103, 319(1976).] A csillapítás mértékét valószínűleg a sejtben fennálló triptofán-koncentráció szabályozza, és a vad típusú Escherichia coli baktériumoknál — általában tíz eset közül kilencben — a csillapító úgy szünteti meg a triptofán-képződést, hogy egy másodlagos szerkezet vagy „lezáró ág” jön létre az üzenethordozó RNS-ban, és ennek hatására az RNS polimeráz idő előtt elválik a megkötött DNS-től. Más kutatók a heterológ polipeptidek képződésének mérésére próbálták felhasználni a trp operont. Megkíséreltek olyan problémákkal foglalkozni, mint amilyen az indo'lil-akrilsav hozzáadásával történő visszatartás, I és csillapítás. Az indolil-akrilsav indukáló hatású, a triptofánnal analóg, amely „versenyez” a triptofánnal a trp visszatartó (represszor) molekuláért. Ilyen módon kompetitiv gátlás alakul ki. Egyidejűleg az indukáló megszünteti a csillapítást, mivel gátolja az indolnak enzimes úton triptofánná történő átalakulását, és így hatékonyan vonja meg a triptofánt a sejttől. Ennek eredményeként több polimeráz képes a csillapító sikeres „végigolvasására”. Ez a megközelítési módszer azonban problematikusnak tűnik a következetesen és jó termeléssel történő lefordítás szempontjából, mivel a trlptofántartalmú fehérjeszekvenciák idő előtt lezáródtak a szintézis során a felhasználható triptofán hiánya következtében. Ennél a megoldásnál a hatékony csillapításcsökkentés teljes mértékben a súlyos triptofánhiányon múlik. A találmány szerint másmilyen módon foglalkozunk a triptofán visszatartással és csillapítással kapcsolatos problémákkal. A találmány (1) eljárást biztosít olyan hordozó előállítására, amelynek segítségével közvetlenül nyerhetők heterológ gének a trp promotor-operátorból; (2) eljárást biztosít olyan hordozók előállítására, amelyekkel a triptofán opcrátor-promotorból specifikusan hasítható, homológ-heterológ gén-fúziókkal kódolt polipeptidek állíthatók elő; és (3) eljárást biztosít heterológ polipeptidek szabályozható, hatékony és jó termeléssel történő előállítására. A találmány szerint a heterológ polipeptideknek baktériumokkal történő termelésére biztosított új, plazmid jellegű hordozó egy kétszálú DNS szekvenciából áll, amely a kódoló szál első 5' végétől a második 3' végéig azonos fázisban a következőket tartalmazza: trp promotor-operátor, a trp vezető riboszóma kötődési helyet kódoló nukleotidok és a heterológ polipeptid aminosavszekvenciáját kódoló szerkezeti gén kifejezéséhez a „lefordítás” beindítását kódoló nukleotidok. A fentebb említett DNS szekvencia nem tartalmaz sem trp csillapító tartományt, sem olyan nukleotidokat, amelyek a trp E riboszóma kapcsolódási helyét kódolják. Ehelyett a trp vezető riboszóma kötődési helyet használjuk fel a beillesztett génben tárolt információ kifejezésére. A baktériumsejteket transzformáljuk a találmány szerinti, trp promotor-operátort tartalmazó, csillapítóval nem rendelkező plazmidok hozzáadásával, majd triptofán adalékanyag jelenlétében szaporítjuk őket. Triptofánban gazdag táptalaj alkalmazása elegendő triptofánt biztosít ahhoz, hogy lényegében teljesen visszatartottak legyenek a trp promolor-opcrátortól a trp/visszatartóig terjedő kölcsönhatások, és így a sejtnövekedést nem akadályozza nagy mennyiségű, heterológ. a beillesztett gén ált;d kódolt polipeptid idő előtti képződése. Amikor a rekombinációval képződő kultúra mennyisége elegendő a polipeptid ipari méretű termeléséhez, eltávolítjuk a külső triptofánforrást, és hagyjuk, hogy a baktériumsejtek csupán az általuk termelt triptofán felhasználására támaszkodhassanak. Az eredmény enyhe triptofánhiány. és ennek megfelelően a bioszintézis visszatartása megszűnik, a heterológ génbetét termelése hatékonnyá válik, és ezt nem tompítja a csillapítás, mivel a csillapító-tartomány kiiktatódott a rendszerből. Ilyen módon a sejtekből soha nem fogy ki a triptofán, és az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
