195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
I 195 533 2 ! énként 20 pg antibiotikumot tartalmaz. 2 napon át inkubáljuk a tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten, amiután transzformálódott sejtekből származó telepek jelennek meg. Ezek a telepek a-amiláz-aktivitással rendelkeznek, ahogy azt a jódgőzzel való festési módszerrel bizonyítjuk. Az egyik kiónt B. subtilis CL 8001 (pCH 1) jellel jelöljük, és 1981. január 13-án letétbe helyeztük NCIB 11629 sorszám alatt. Ugyancsak letétbe helyeztük az eredeti QB 1133 törzset, a letétbe helyezés dátuma: 1981. január 13., a törzsgyűjteményben kapott sorszám: NCIB 11628. A B. subtilis CL 8001 (pCH 1) csak kloramfenikol jelenlétében stabil. A törzset a-amiláz előállítására használjuk oly módon, hogy 20 pg/ml kloramfenikolt tartalmazó táptalajban tenyésztjük. Az «-amiláz könnyen elkülöníthető a táptalajból. Egy éjszakán át kloramfenikol jelenlétében tenyésztett fermentlében az alábbi mennyiségű o-amilázt mérjük. Felülúszó Sejtek Teljes egység/liter egység/liter egység/liter 136 14 150. 3. példa A ß-amildzt meghatározó gén klónozása Donor mikroorganizmusként Bacillus cereus sejteket használunk, ezeket az 1 466 009 számú brit szabadalmi leírásból ismerjük (Agency of Industrial Science & Technology, Japán). A törzset a Fermentation Research Institute of Chiba-shi intézetben helyezték letétbe (Japán, 1973. december 20., sorszáma: FERM-P 2391). A törzs az American Type Culture Collection törzsgyűjteményében szintén megtalálható ATCC 31102 sorszámmal (1974. december 26.). A törzs az irodalom szerint jí-amilázt és «-1,6-glükozidázt is termel. A) A (3-amiláz gén klónozása a lambda NM 781 fágban A 2. példában megadottakat ismételjük meg a restrikciós kísérlet, a ligáció és a rekombináns fágok elkülönítése kapcsán. A 2 pg mennyiségű B. cereus dezoxiribonukleinsavat normál reakciókörülmények között hasítjuk az Eco Rí restrikciós enzimmel. Az 1,25 pg lambda NM 781 fág vektor dezoxi-ribonukleinsavat szintén az Eco Rí enzimmel kezeljük. A ligációs reakciót és fehérjeburokba való zárást az előzőekben megadottak szerint végezzük. Több amiláz-aktivitással rendelkező rekombináns fágot találtunk (1—500). Ezek közül egyet lambda NM 781 ß Amy 1 jellel jelölünk, és 1980. február 12-én NCIB 11574 sorszámmal letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteménybe. « B) A lambda NM 781 ß Amy 1 /0-amiláz gén reklónozása a pBR 322 plazmidba Az enzimtermelés növelésére az első |3-amiláz kiónt használjuk /3-amilázt meghatározó forrásként, és szubklónozzuk a többpéldányú pBR 322 plazmidba. 2 pg lambda NM 781 ß Amy 1 dezoxi-ribonukleinsavat és 1 pg pBR dezoxi-ribonukleinsavat hasítunk az Eco Rí enzimmel, keverjük a fragmenseket és T4-Iigázzal kezeljük. A ligációs reakciót és a transzformációt az előzőekben megadottak szerint végezzük. A 200 ampicillin-rezisztens telep közül egy keményítő-hasító aktivitással rendelkezett. Ezt izoláltuk, és E. coli CL 7004 (pCP 3) jellel jelöljük; a törzset 1980. szeptember 15-én NCIB 11602 sorszámmal letétbe helyeztük. c) A 0-amiláz gén reklónozása E. coli sejteket lizogenizáló lambda-fágba Vektorként a 2. példában leírt hőérzékeny lambda T4 lig Cl 857 Warn Earn Sam (lambda NM 989) dezoxiribonukleinsavat használjuk. 1 pg pCP 3 dezoxi-ribonukleiiisavat és 0,5 pg fág dezoxi-ribonukleinsavat Eco RI-al hasítunk, a fragmenseket összekötjük, és a kapott dezoxi-ribonukleinsav darabokat in vitro fehérjeburokba zátjuk. Izoláljuk az amiláz-aktivitást meghatározó fág-részecskéket, és az előzőekben megadott módon lizogén telepeket állítunk elő velük. Izoláljuk az E. coli C 600 erre a rekombináns fágra lizogén törzset, E. coli CL 7005 (lambda ß Amy 1) jellel jelöljük. A törzset 1980. szeptember 15-én NCIB 11603 sorszámmal letétbe helyeztük. D) Az amilázt meghatározó gén termékének amplifikálása Az összes kiónban és szubklónban az amiláz-aktivitást DNS-módszerrel határoztuk meg. A 0-amiláz aktivitást vékonyréteg-kromatográfiával mérjük oly módon, hogy az amilózt emésztve, maltóznak megfelelő, egyetlen foltot kapunk. A /3-amiláz gén különböző kiónokban való amplifikálását az előzőekben megadottak szerint végezzük. A II. táblázatban ismertetjük az eredeti törzs és három klón enzim-aktivitását. Az aktivitást vagy a fág-lizátumból, vagy a 2. példában megadottak szerint végzett ozmotikus sokk után mértük. 4. példa A pullulanáz gén klónozása Donor mikroorganizmusként a Klebsiella pneumoniae törzset használjuk [Bender írja le, Biochem. Z., 334, 79-95 (1961)]. A törzset az ATCC 1 törzsgyűjteménybe helyeztük letétbe 1963. június 6-án, 15050 sorszám alatt. A törzs szerepel Staley 1 273 789 számú brit szabadalmi leírásában is. 2,25 pg donor dezoxi-ribonukleinsavat különítünk el, és ismert reakciókörülmények között Eco Rí enzimmel hasítjuk. Hasonló enzimmel hasítunk 1,25 pg lambda NM 781 dezoxi-ribonukleinsavat, a reakciót a fentihez hasonló körülmények között végezzük. Az inkubációt 3 órán át 37 °C hőmérsékleten végezzük, ezután oly módon állítjuk le a reakciót, hogy az elegyet 10 percen át 75 °C hőmérsékleten tartjuk. A restrikciós enzimek hatását a 2. példában megadottak szerint ellenőrizzük. A hasított dezoxi-ribonukleinsavakat ligációs reakció-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
