195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
1 195 533 2 II. Táblázat Az extracelluláris és a sejthez kötött 0-ami!áz aktivitás B. cereus-ban és a rekombinációs kiónokban Extracelluláris aktivitás, cgység/liter % (1) Sejthez kötött aktivitás, cgység/liter % összaktivitás, egység/llter B.cereus (2) ATCC 31102 1420 nem határoztuk meg 1420 lambda NM 781 beta Amy 1 80 80 E. coli CL 7004 (pCP 3) (3) 59 77,2 17,4 22,8 76,4 E. coli CL 7005 (lambda beta Amy 1) (4) 19 44,2 24 55,8 43 (1) = Sejthez kötött aktivitás: lizoziminal kezeltük a sejteket, amely azok líziséhez vezetett. (2) = 30 °C hőmérsékleten egy éjszakán át tenyésztünk az alábbi táptalajon: élesztőkivonat: 1 %; bactotryptone: .1%; nátrium-klorid : 0,5 %. (3) = 37 °C hőmérsékleten tenyésztünk a fentihez hasonló összetételű táptalajon. (4) = A tenyészetet 32 °C-on, 45 °C-on, majd 37 °C-on végezzük, az aktivitást a felühiszúhan és a sejtekben határozzuk meg a lízist követően, ahogy azt az E. coli lambda a Amy 1 kapcsán ismertettük a 2. példában. nak vetjük alá, izoláljuk a terméket, és E. coli HB 101 sejteket transzformálunk. Minden esetben a 2. példában megadottak szerint járunk el. 1 fi g lambda dezoxi-ribonukleinsavra számítva 2X10S plakk-képző egységet kapunk. Két napon át 37 °C hőmérsékleten BBL Trypticase plusz 0,25 % pullulán táptalajon inkubálva egyes plakkok pullulanáz-aktivitást mutatnak, azaz ezek a túlnövekvő baktériumokra jellemző, homályos gyűrűvel vannak körülvéve. A pullulanázt termelő fágok aránya 1:2500. Egy ilyet kiválasztottunk, és lambda NM 781 Pul 1 jellel jelöljük; 1980. április 9-én NCIB 11593 sorszámmal E. coli HB 101-be építve letétbe helyeztük az NCIB törzsgyűjteményébe. A pullulanáz-aktivitást dinitro-szalicilsav-módszerrel [Angi. Biochem. 45, 510 (1972)] határoztuk meg, a 25 pullulán hidrolízist követően a fág lizátumokban maitotriózt mutatunk ki vékonyréteg-kromatográfiás módszerrel. , A lambda NM 781 Pul 1 nagyméretű dezoxi-ribonukleinsav-fraginenst tartalmaz, amely a Klebsiella 30 pneumoniae-ből származik, nagysága 13,5 Kb. Ezt a fragmenst Eco Rí enzimmel újra hasítjuk két részre; ekkor 6,1 Kb és 7,4 Kb nagyságú fragmenseket kapunk. A 6,1 Kb nagyságú szubfragmenst újraklónozzuk lambda NM 781-be. majd bizonyítjuk a pullulanázt meghatározó 35 gén jelenlétét. Ezt az új rekombináns fágot lambda NM 781 Pul 2-nek neveztük el, és 1980. szeptember 15-én NCIB 11604 sorszámmal E. coli HB 101-be építve letétbe helyeztük. A 6,1 Kb nagyságú fragmenst a pACYC 184 több- 40 példányú plazmidba [előállítását lásd Chang, Cohen: III. Táblázat A Klebsiella pullulanáz kifejeződése E. coli kiónokban. Az aktivitást 1 liter tenyészetre számítva maltóz ekvivalens egységekben adjuk meg Felülúszó Membrán összes Az enzimtermelés fokozódása Klebsiella pneumonia + maltóz 24 3,5 27,5 1 / NM 781 Pul 1 0,76 2,6 3,86 0,14 1 NM 781 Pul 1 + maltóz 2,2 9,84 12,04 0,44 /NM 781 Pul 2 9.6 23,8 32,9 1,19 /NM 781 Pul 2 + maltóz 8,6 26,7 35,3 1,28 *E. coli CL 7006 (pCP 4) nem mértük 3,4 3,4 0,123 *E. coli CL 7006 (pCP 4) + maltóz nem mértük 114 114 4,14 **E. coli CL 7007 (lambda Pul 3) + maltóz 47 93,5 140,5 5,13 * = Egy éjszakán át tenyésztjük. ** = A tenyésztést 32 °C-on, 45 °C-on, ezt követően 37 °C hőmérsékleten végeztük, az aktivitást a felülúszóban, és a sejtekben is megmértük, lízist követően, ahogy azt a 2. példában megadjuk az E. coli lambda a Amy 1 kapcsán. 11
