195533. lajstromszámú szabadalom • Eljárás génsebészeti úton módosított mikroorganizmusok előállítására amiláz előállítás céljára
J. Bacteriol. 134, 1141-56 (1978)] szubklónozzuk. (Ez a plazmid a pBR 322 származéka, tartalmazza a Tcr gént, és a CmR gént; egyetlen Eco RI hellyel együtt.) Az új kiónt E. coli CL 7006 (pCP 4) névvel jelöljük, és 1980. szeptember 15-én NCIB 11605 sorszámmal letétbe helyeztük. Előállítunk egy harmadik szubklónt is, oly módon, hogy a 6,1 Kb nagyságú fragmenst a lambda NM 989 fágba [előállítását lásd Murray és munkatársai: Molec. Gen. Genet. 150, 53—61 (1977)] juttatjuk, ahogy a 2. példában megadtuk. A kiónt E. coli CL 7007 (lambda Pul 2) jellel jelöljük. A törzset 1980. szeptember 15-én helyeztük letétbe NCIB 11606 számon. Az összes kiónban vizsgáljuk a pullulanáz kifejeződésének mértékét és az amplifikációt. Az eredményeket a III. táblázatban adjuk meg. Ahogy az a táblázat adataiból kiderül, a pullulanázaktivitást maltózzal indukáljuk, az LB táptalajhoz 0,04% maltózt adagolunk. A pullulanáz kinyerésére a membrán frakciót Tryton X 100-zal kezeljük; ez azt jelenti, hogy az aktivitás a membránon lokalizálódik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus megaterium gént tartalmazó rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy B. megaterium DNS-t és valamely lambda fág DNS-t valamely restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely DNS ligáz segítségével ligáljuk, majd defektiv lambda fág lizátumokkal egyesítjük, a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coliból amiláz aktivitású telepeket izolálunk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó B. megaterium gént tartalmazó rekombináns DNS-t kapunk. (Elsőbbsége: Í980. 02. 15.) 2. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus megaterium gént tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy B. megaterium gént tartalmazó, 1. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-t és antibiotikumrezisztenciával rendelkező plazmidot valamely restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely DNS ligázzal ligáljuk, a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coli telepekből az antibiotikumrezisztenciát mutató telepeket szelektáljuk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó B. megaterium gént tartalmazó plazmidot kapunk. (Elsőbbsége: 1980. 02. 15.) 3. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus coagulans gént tartalmazó rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy B. coagulans DNS-t és valamely lambda fág DNS-t valamely restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely DNS ligáz segítségével ligáljuk, majd a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coliból amiláz aktivitású telepeket izolálunk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó E. coaguláns gént tartalmazó rekombináns DNS-t kapunk. (Elsőbbsége: 1980. 02. 15.) 4. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus coagulánst gént tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy B. coagulans gént tartalmazó, valamely 3. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-t és valamely plazmidot restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket DNS ligázzal ligáljuk, a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coli telepekből az amiláz-aktivitást mutató telepeket szelektáljuk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó B. coaguláns gént tartalmazó plazmidot kapunk, (Elsőbbsége: 1980. 02. 15.) 5. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus coaguláns gént tartalmazó B. subtilis törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy egy E. coliba beépített és a 4. igénypont szerint előállított B. coaguláns gént tartalmazó plazmidot restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított terméket valamely DNS ligáz segítségével B. subtilisban replikálódó, hasonló módon hasított plazmid-fragmensekkel ligáljuk, a kapott anyaggal B. subtilist fertőzünk, a fertőzött B. subtilis telepekből az amiláz-aktivitást mutató telepeket szelektáljuk. (Elsőbbsége: 1980.02. 15.) 6. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus cereus gént tartalmazó rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy B. cereus DNS-t és valamely lambda fág DNS-t valamely restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely ligáz segítségével ligáljuk, majd a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coliból amiláz aktivitású telepeket izolálunk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó B. cereus gént tartalmazó rekombináns DNS-t kapunk. (Elsőbbsége: 1980. 02. 15.) 7. Eljárás amilázt meghatározó Bacillus cereus gént tartalmazó plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy B. cereus gént tartalmazó. 6. igénypont szerint előállított rekombináns DNS-t és valamely plazmidot restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely DNS ligázzal ligáljuk, a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coli telepekből az amiláz-aktivitást mutató telepeket szelektáljuk, és így E. coliba beépítve amilázt meghatározó B. cereus gént tartalmazó plazmidot kapunk. (Elsőbbsége: 1980. 02. 15.) 8. Eljárás pullulanáz-termelést meghatározó Klebsiella pneumoniae gént tartalmazó rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy K. pneumoniae DNS-t és valamely lambda fág DNS-t restrikciós endonukleázzal hasítunk, a hasított termékeket valamely DNS-ligáz segítségével ligáljuk, majd a kapott anyaggal E. colit fertőzünk, a fertőzött E. coliból pullulanáz aktivitású telepeket izolálunk, és így E. coliba beépített pullulanázt meghatározó K. pneumoniae gént tartalmazó rekombináns DNS-t kapunk. (Elsőbbsége: 1980. 04. 10.) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 4 ábra oldal
