195523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hialuronsav frakciók és ilyen terméket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 195 523 2 keverést 12 órán át folytatjuk. Az elegyet lehűtjük 25 °C-ra, majd szűrjük, először CeliteR oszlopon, majd 1 pm-es szűrőn keresztül. A kapott elegyet ezután ismét molekulaszűrőn, ultraszűréssel tisztítjuk, olyan membránt használva, amely a 30 000-nél nagyobb molckulatömegű molekulákat tartja vissza. Az ultraszűrést az eredeti térfogat háromszorosával végezzük, 0,33 mól-os vizes nátrium-klorid oldat hozzáadásával. Ezután megszüntetjük a nátriumklorid oldat hozzáadását, és az oldat térfogatát az eredeti térfogat egynegyedére csökkentjük. A koncentrált oldatot ezután 25 °C hőmérsékleten, 60 g/perc sebességgel végzett keverés mellett 3 térfogat 95%-os etanol hozzáadásával kicsapjuk. A csapadékot centrifugálással összegyűjtjük és a felülúszó folyadékfázist elkülönítjük. A csapadékot feloldjuk 1 liter 0,1 mól-os vizes nátrium-klorid oldatban, és a lecsapási eljárást további 3 térfogat 95 %-os etanol felhasználásával megismételjük. A csapadékot összegyűjtjük és mossuk,először háromszor 75 %-os etanollal, majd háromszor abszolút etanollal, végül háromszor abszolút acetonnal. Az így kapott termék (Hyalastine + Hyalectin frakció) átlagos molekulatömege 250 000 és 350 000 között van. A hialuronsav-kitermelés az eredeti friss szövet 0,6 %ának felel meg. 2. példa Eljárás a Hyalastine frakció elkülönítésére az 1. példában kapott elegyből Az 1. példa szerinti eljárással kapott elegyet feloldjuk pirogén-mentes desztillált vízben, 10 mg anyag/1 ml vízmennyiségben. Az így kapott oldatot ultraszűréssel molckulnszűiőn tisztítjuk, olyan membránt alkalmazva, amely a 200 000-nél nagyobb molekulatömegű molekulákat tartja vissza, koncentrálási technikával, anélkül, hogy a membránra vizet öntenénk. A 200 000 kizárási határral működő membránon keresztül végrehajtott ultraszűrési eljárás során a 200 000-nél nagyobb molekulatömegű molekulák nem jutnak át a szűrőn, míg a kisebb molekulák a vízzel együtt áthaladnak a szűrőn. A szűrési eljárás során nem adunk vizet a membrán fölötti rekeszbe, ezért a rekeszben a térfogat, a 200 000- nél nagyobb molekulatömegű molekulák koncentrációjának növekedésével párhuzamosan csökkenni fog. Az ultraszűrést addig folytatjuk, míg a membránon mért térfogat az eredeti térfogat 10%-ára nem csökken. A membránra ezután 2 térfogat pirogén-mentes kétszer desztillált vizet adunk, és az oldatot újból ultraszűijük mindaddig, míg a térfogat az eredeti térfogat egyharmadára nem csökken. Az eljárást további két alkalommal megismételjük. A membránon áthaladt oldatot nátrium-kloriddal 1,0 mól-osra állítjuk be, majd 4 térfogat 95 %-os etanollal kicsapjuk. A csapadékot háromszor 75 %-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. Az így kapott termék (Hyalastine frakció) átlagos molekulatömege 50 000 és 100 000 között van. A hialuronsavra számított kitermelés az eredeti friss szövet 0,4%-ának felel meg. 3. példa Eljárás a Hyalectin frakció kinyerésére A 2. példában előírt módon a 200 000-nél nagyobb molekulatömcgű molekulákat visszatartó molekulaszflrő membránjáról összegyűjtött koncentrált oldatot vízzel hígítjuk mindaddig, amíg egy 5 mg/ml hialuronsavkcncentrációjú oldatot nem kapunk. A koncentrációt a glükuronsav mennyiségének kvantitatív meghatározásán alapuló analízissel állapítjuk meg. Az oldatot nátrium-kloriddal 0,1 mól-osra állítjuk be, majd 4 térfogat 95%-os etanollal kezeljük. A kivált csapadékot háromszor 75 %-os etanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk. A kapott termék (Hyalectin frakció) átlagos molekulatömege 500 000 és 730 000 között van. Ez egy nagytisztaságú, kb. 2500 -3500 lánchosszúságú szacharidegységeket tartalmazó hialuronsav-frakciónak felel meg. A hialuronsav-kitermelés az eredeti friss szövet 0,2%-a.. 1. A hialuronsav frakciók scjtmobilizációs biológiai aktivitása. A HA-frakciók sejtmobilizációs aktivitásának vizsgálatára a fibroblasztok tenyészetben mutatott leválasztási aktivitásának meghatározásából álló jól ismert módszert használtuk. Egerek BALB 3T3 sejtjeit növesztettük Dulbeco által módosított Eagle táptalajon, amelyet 10% borjúszérummal, 250 egység/ml penicillinnel és 0,25 mg/ml streptom /cinnel egészítettük ki, és 5 % széndioxidot és 95 % le'egőt tartalmazó nedves atmoszférában 37 C-on inkubáltunk. Kísérleti célokra a sejteket szokásos módon 6C mm átmérőjű műanyag edényekbe helyezett szövette íyészetekbe inokuláltuk (6X10S sejt/edény). A 3T3 sejtek monorétegeit dekantáltuk, majd 2,0 mg/ml koncentrációban a különböző HA-frakciókat tarta’mazó friss táptalajt adtunk hozzá. Meghatározott időközönként megfigyeltük a sejtek leválását, részben m kroszkópos úton, részben megszámolva a mobilizált sejtek számát Coulter számlálóval. Leválási vizsgálat: A leválási kinetika megvizsgálása céljából a sejteket műanyag edényekbe inokuláltuk, és 24 órán át növeszte tűk. Ezután a táptalajt dekantáltuk, majd friss, 2,0 mg/ml HA-t tartalmazó táptalajt adtunk hozzá. Minden 2i órában két edényt, egy a vizsgált tenyészetet és egy, a kontroll tenyészetet tartalmazót, dekantáltunk, és m nd a feliilúszóban lévő sejtek számát, mind a kapcsoló ló sejtek számát meghatároztuk Coulter számlálóval. A következő 3. táblázatban az 1 -3. példák szerint előállított találmány szerinti frakciókkal kapott kísérleti eredményeket foglaljuk össze. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 5
