195523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hialuronsav frakciók és ilyen terméket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 195 523 2 3. Táblázat A mozgékonysági vizsgálatok eredményei Frakció Koncentráció (mg/ml) A levált sejtek száma a kontrolihoz viszonyítva %-os hatékonyság a kontrolihoz viszonyítva Kontroll 2X 106 Hyalectin + Hyalastine 2 3,5X 10ö 75 Hyalectin 2 2.1X106 5 Hyalastine 2 5X106 150 A 3. táblázatban feltüntetett adatokból látható, hogy a llyalastinc frakció jó scjtmobilizdciós aktivitással rendelkezik, ezért alkalmas a sebgyógyulás elősegítésére, A Hyalastine-nek ez a sejtmobilizációs aktivitása elősegíti az új sejtek migrációját és szaporodását, ha gyógyászati készítmény formájában a sérült szövetrészre visszük fel. Ugyanakkor a Hyalectin frakció sejtmobilizációs aktivitása igen alacsony, ezért ez a frakció nem alkalmas a sebgyógyulás elősegítésére. Ugyanakkor a Hyalectin nagy átlagos molekulatömegű és belső viszkozitása következtében okuláris és intraartikuláris injekció céljára használható, és éppen elhanyagolható sejtmobilizációs aktivitása miatt különösen alkalmas intraokuláris és intraartikuláris célokra. 2. A hialuronsav frakciók gyulladáskeltő aktivitása. A gyulladáskeltő hatás vizsgálatára az intraokuláris alkalmazás után mért támadó sejthám meghatározását használtuk házinyúlakon végzett kísérletekben. Módszer Ehhez a vizsgálathoz öt, egyenként kb. 2 kg-os, ellenőrzötten tökéletes látású új-zélandi vagy kaliforniai nyulat használtunk. A szemek külső részén makroszkopikus szinten, míg a belső részen optalmoszkóppal megvizsgáltuk, hogy nincsenek-e gyulladásos folyamatok. Ha a szemfenék világosan látható és normális, a kísérlet végrehajtható. A kiválasztott állatokat néhány csepp, a szemészetben szokásos steril érzéstelenítő felhasználásával helyi érzéstelenítésben részesítjük, és néhány csepp szemészeti célra alkalmas atropin oldatot is juttatunk az állatok szemébe. A vizsgálatot steril körülmények között végezzük. A szemgolyót megnyomjuk, és a szemfehérjén keresztül, kb. 5-6 mm-re a szaruhártya szélétől az üvegtest közepébe 100 ß\ oldatot injektálunk, 26G-os tűt használva. A másik szemet kontrollként használjuk. A kezelt szembe két csepp antibiotikum oldatot juttatunk, majd az állatokat egyenként ketrecekbe zárjuk. 50—60 óra elteltével a kísérletet tovább folytathatjuk. A szemek vizsgálatára ugyanazt a módszert alkalmazzuk, mint az állatok kiválasztásánál. Az állatokat Pentothal intravénás injekcióval pusztítjuk el. Ezután először összegyűjtjük a csarnokvizet (0,2 ml) 26G-s inzulinfecskendő segítségével. Ezután a szemgolyókat kihámozzuk, megszabadítjuk minden idegen anyagtól, só-oldattal mossuk, szárítjuk, felmetsszük és Petri-csészékben 6 felnyitjuk, az üvegtest főrészét elkülönítjük és steril fecskendővel összegyűjtjük (kb. 0,7 ml). Az üvegtestet kis polietilén kémcsövekbe helyezzük, és 50 jul hiarulonidázt (100 E/ml) adunk hozzá. Az elegyet ezután kb. 3 órán át 37 °C-on tartjuk, hogy az oldat viszkozitását csökkentsük. A leukociták számát 120-szoros nagyítású fáziskonraszt mikroszkóppal határozzuk meg Burker-kamrában. Minden mintán több számlálást végzünk, kiszámítjuk az átlagértékeket, és a kapott eredményt leukocita szám/mm3-ben fejezzük ki. A próbát a következő esetben tekintjük pozitívnak: 1. A vizsgált szemek nem mutatják a sérülés nyomait, és 2. öt kezelt szemből legalább négy esetében az átlagos leukocita szám nem haladja meg a 200/mm3-t és egyik kontroll szem esetében mért átlagos leukocita szám sem haladja meg az 50/nim3-t. Az 1-3. példák szerint előállított HA-frakciók vizsgálata során ebben a kísérletben kapott eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze. 4. Táblázat A gyulladáskeltő hatás vizsgálatának eredményei Frakció A támadó sejtek száma Kontrol! 25 Hyalastine + Hyalectin 32 Hyalastine 20 Hyalectin 22 gyulladáskeltő frakció (átlagos molekulaszáni: 30 000) 150 kakastaréjból származó teljes hialuronsav (RF. Swann D. A. 1968. B. B. A. 156, 17-29) 120 A 4. táblázatban közölt adatokból látható, hogy a Hyalastine és Hyalectin frakciók nem mutatnak a kontrolinál erősebb gyulladáskeltő hatást, és az egyesített Hyalastine és Hyalectin frakció gyulladáskeltő hatása is csak elhanyagolható mértékben haladja meg a kontroliét. Ennek megfelelően a Hyalastine és a Hyalectin frakciók gyógyászatilag alkalmazhatók, anélkül, hogy nemkívánatos gyulladáskeltő mellékhatással kellene számolni. Ezek az eredmények újabb bizonyítékot szolgáltatnak annak a felismerésünknek az alátámasztására, hogy a gyulladáskeltő mellékhatásért a 30 000-nél kisebb átlagos molekulatömegű HA-frakciók a felelősek. A kakastaréjból Swann módszerével elkülönített hialuronsav (Swann D. A. 1968, B. B. A. 156,17-29) jelentős gyulladáskeltő hatást mutat. Kimutattuk, hogy a kb. 50 000 és 10000Q közötti átlagos molekulatömegű Hyalastine frakció jó sejtmobilizációs aktivitást mutat, ezért jól használható a sebgyógyulás elősegítésére anélkül, hogy nemkívánatos gyulladásos reakciókkal kellene számolni. Kimutattuk továbbá, hogy a Hyalectin frakció, amelynek átlagos molekulatömege kb. 500 000 és 730 000 között van, jól használható okuláris és intraartikuláris injekciók céljára, elsősorban nagy molekulatömege és belső viszkozitása következtében, ugyanakkor nem mutat sem.sejt-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
