195523. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hialuronsav frakciók és ilyen terméket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 195 523 2 2. Táblázat Kémiai és fizikai jellemzők Frakciók Molekulatömeg Dinamikus viszkozitás 20 °C-on A száraz por hiarulonsav titere Protein-tartalom (szarvasmarha) albumínként Szulfurált micopoliszaharidok Hyalastine 4- Hyalectin 250 000-350 000 100 mP.s. (konc. l%m/v) 96 %a 0,5% 1% Hyalastine 50 000 - 100 000 600 tnP.s. (konc. 5 % m/v) 96% 0,5 % 1% Hyalectin 500 000 - 730 000 170 mP.s. (konc. 1 % m/v) 96% 0,5% 1% :,Az értékek a víz eltávolítása utáni 11A titert jelentik. Például a 96%-os tiler azt jelenti, hogy a víz eltávolítása után a por 4% szennyezést és 96% hialuronsavat tartalmaz. ultraszűrés során a membránon visszatartott elegyet összegyűjtjük, és így egy 500 000 és 730 000 közötti átlagos molekulatömegű harmadik, a jelen leírásban Hyalectinenek nevezett hialuronsav-frakciót különítünk el. A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként felhasználásra kerülő nyers hialuronsav-elegynek az első molekulaszűrés előtti proteináz enzimes kezelése, amelyet célszerűen papain enzimmel végezhetünk, nem feltétlenül szükséges, azonban a gyakran enzimes emésztés útján lebontható szennyezéseket tartalmazó nyers hialuronsav-tartalmú elegyek szennyezéseinek lebontása útján megkönnyítheti a nyers elegy további feldolgozását. Találmányunk további részleteit a következő példákkal szemléltetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. 1. példa Eljárás gyulladáskeltő hatást nem mutató Hyalastine és Hyalectin frakciók elegyénck előállítására 3000 g friss vagy fagyasztott tyúktarajt húsdarálóval apróra vágunk, majd mechanikai homogenizátorban gondosan homogenizálunk. A kapott pépszerű anyagot A1SI 316 típusú rozsdamentes acélból készült, vagy üvegtartályba helyezzük, majd 10 térfogat vízmentes acetont adunk hozzá. Az egész elegyet ezután 6 órán át 50 gfpcrc sebességgel keverjük, 12 órán át állni hagyjuk, majd az acetont leszívatjuk és elöntjük. Ezután az extrakciós eljárást addig ismételjük, amíg az elkülönített aceton eléri a megfelelő nedvességi szintet (Karl—Fischer eljárás). A kapott anyagot ezután centrifugáljuk és alkalmas hőmérsékleten 5-8 órán keresztül vákuumban szárítjuk. Ezzel a módszerrel megközelítőleg 500-600 g száraz, porszerű anyagot kapunk. A kapott száraz por 300 g-nyi mennyiségét ezután foszfát-pufferrel puffereit vizes közegben, alkalmas mennyiségű cisztein-hidroklorid jelenlétében 0.2 g papainnal enzimatikusan kezeljük. Az elegyet 60—65 °C állandó hőmérsékleten 60 g/perc sebességgel 24 órán át keverjük. A masszát 25 °C-ra hűtjük, hozzáadunk 60 g CeliteR-t és a keverést további egy órán át folytatjuk. 4 20 A kapott elegyet addig szűrjük, amig tiszta folyadékot nem kapunk. Ezt a tiszta folyadékot azután molekulaszűrőn ultraszűréssel tisztítjuk, olyan membránt használva , amely a 30 000-néi nagyobb molekulatömegű 25 molekulákat tartja vissza. Az ultraszűrést desztillált víz folyamatos adagolása mellett, az eredeti térfogat 5-6- szorosával végezzük. Ezután abbahagyjuk a desztillált víz adagolását, és az ultraszűrést addig folytatjuk, amíg az elegy térfogata az eredeti térfogat egyharmadára nem 30 csökken. A visszamaradó folyadékot nátrium-klorid hozzáadásával 0,1 mól-ra állítjuk be, és a hőmérsékletet 50 °C-ra emeljük. Hozzáadunk 45 g cetil-piridinium-kloridot, miközben a terméket 6Ö g/perc sebességgel keverjük. 35 Az elegy keverését 60 percen át folytatjuk, majd 50 g Ce!iteR-t adunk hozzá. A mozgatás során a termék hőmérsékletét 25 °C-ra csökkentjük,és a kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Az igy kapott csapadékot 5 liter 0,01 mólos nátrium-klorid oldatban szusz- 40 pendáljuk, amely 0,05 % cetil-piridinium-kloridot tartalmaz. A kapott szuszpenziót 50 °C-on további 60 percen át keverjük. A hőmérsékletet 25 °C-ra csökkentjük, és a kivált csapadékot centrifugálással elkülönítjük. A mosási folyamatot ezután 3-szor megismételjük, 45 majd a csapadékot 3 liter, 0,05 mólos, 0,05% etilpiridinium-klorid tartalmú nátrium-kloridot tartalmazó tartályokba gyűjtjük. A tartályok tartalmát 60 çercen át 50 g/perc sebességgel keverjük, majd 2 órán keresztül 25 °C állandó hőmérsékleten tartjuk. A felülúszó fázist 50 ezután centrifugálással elkülönítjük. Az eljárást néhányszor megismételjük 0,1 mólos, 0,05 % cetil-piridinium-kloridot tartalmazó vizes nátrium-klorid oldattal. Az elegyet centrifugáljuk, és a felülúszó folyadékréteget eltávolítjuk. A csapadékot 55 3 liter 0,05% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó 0,3 mólos vizes nátrium-klorid oldatban diszpergáljuk. Ezután az elegyet keverjük, és mind a csapadékot, mind a tiszta folyadékot összegyűjtjük. Az extrakciót a csapadékon további három alkalommal megismételjük, mind- 60 egyik esetben 0.5 liter fenti vizes oldatot használva. Végül a visszamaradó csapadékot elkülönítjük, és a tiszta oldatokat egy tartályban egyesítjük. A folyadék hőmérsékletét keverés közben 50 °C-ra emeljük. A folyadékot ezután nátrium-kloriddal 0,23 mólosra állítjuk 65 be. Hozzáadunk 1 g cetil-piridinium-kloridot, majd a
