195516. lajstromszámú szabadalom • Eljárás sfingosin-származékok előállítására
1 195 516 2 A fenti paraméterek értékelése azt mutatja, hogy a glükosfingolipid-tartalmú kenőccsel kezelt állatok esetében az epitelizált sebfelület hosszabb és a nem-epitelizált sebfelület rövidebb, mint a hatóanyagmentes kenőcsalapanyaggal kezelt állatok esetében. 5 4. vizsgálat Narkotizált patkányokon I cm széles és 5 mm mély ^ szúrt sebeket ejtünk. A scbürcgckbc viszkózcellulózüreges hengeres szivacsot helyezünk. A hengerek üregeibe naponta 100 /il, Of,1-15 /ig/ml glükosfingolipidtartalmú glükosfingolipid-oldatot fecskendezünk. A ^ szivacsokat a behelyezés utáni 16. és 24. napon kivesszük és a hemoglobin-, dezoxiribonukleinsav- és hidroxiprolin-tartalmat meghatározzuk. A glükosfingolipiddcl kezelt sebek esetében a szivacsok a kontroli-állatokénál szignifikáns mértékben több hemoglobint, DNS-t és jq hidroxi-prolint tartalmaznak. 5. vizsgálat 25 Bikarbonáttal és széndioxid-tartalmú légkörrel pH 7,2 értékre pufferolt táptalajon tenyésztett fibroblaszt-sejttenyészeteket bikarbonátot nem tartalmazó és normál légkörben tartott új táptalajba helyezünk. A 7,2 pH-értéket megfelelő, nem-toxikus puffer (pl, 2-[4-(2-hidroxi- 3° etil)-piperazin-l-il]-etán-szulfonsav/nátjriumhidroxid-o!dat (HEPES)] hozzáadásával stabilizáljuk. A glükosfingolipidet nem tartalmazó táptalajon tenyésztett sejtek esetében a növekedés csaknem leáll, míg a hatóanyagtartalmú táptalajban tenyésztett sejtek gyorsan magukhoz térnek 35 és a bikarbonát-tartalmű táptalajon tenyésztett kontrolitenyészetekével azonos növekedést mutatnak. így pl. a glükosfingolipiddcl való háromnapos kezelés után mérjük a növekedés mértékét; a sejteket 5 órán át 3H-timidinnel kezeljük. A sejteket ezután ozmotikus 40 sokkal feltárjuk és a DNS-t dietilamino-etil-szűrőpapíron visszatartjuk. A szűrő radioaktivitását mérjük. Eljárásunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük anélkül, hogy az oltalmi kört a példákra korlátoznánk. 45 Az *H—NMR spektrumokat a Bruker cég (Spectrospin, Industriestrasse 26, CH-8117 Fällende (Zürich) 250 MHz WM 250 Cryospec készülékével mérjük. Az eltolódásokat tetrametil-szilán (TMS) belső standardra vonatkoztatjuk és ppm-ben adjuk meg. 50 A megadott olvadáspontok réztömbben meghatározott korrigálásán értékek. Az analitikai vékonyréteg-kromatografáláshoz (DC) az, E. Merck AG. Darmstatt (Német Szövetségi Köztársaság) cég kovasavgél-lemczeit alkalmazzuk. A vékonyréteg- 55 kromatogramokat (nem UV-aktív rjnyagok esetében) 15%-os kénsavva! permetezzük és 120 °C-on hívjuk elő. A preparatív oszlopkromatografálást a Merck cég kovasavgél-60 (0,62—0,200 mm) lemezeivel végezzük el. A közepes nyomású kromatografáláshoz Flockerzi D. 60 féle „LiChroprep Si 60,15—15” készlemezeket [Diplomamunka, stuttgarti egyetem (1978)] alkalmazunk. A kitermeléseket arra a tisztítási lépésre adjuk meg. amelynél NMR-spektroszkópiával és vékonyréteg-kromatográfiás úton szennyezések nem mutathatók ki 65 A kiindulási anyagok előállítása a) Tetradekanál 32,3 g (150 millimól) piridinium-klór-kromátot szobahőmérsékleten erős keverés közben 200 ml vízmentes metilén-kloridban szuszpendálunk és 21,4 g (100 millimól) tetradekanol és 20 ml vízmentes metilén-klorid oldatával elegyítünk. A reakcíóelegy forrásba jön. A reakció kb. másfél óra alatt befejeződik. A terméket cíekantáljuk, kb. 200 ml vízmentes éterrel mossuk, szántjuk és az oldószert eltávolítjuk. Kovasavgélen történő kromatografálás és 9 :1 arányú benzin (fp.: 35—80 °C) - Jtilacetát eleggyel végzett eluálás után 18 g cím szerinti vegyül etet kapunk, kitermelés 84%. b) Hexadekanál 21,5 g (100 millimól) piridinium-klór-kromátot 200 ml vízmentes diklór-metánban szuszpendálunk. 36 g (66 millimól) hexadekanol 50 ml vízmentes diklórmetánnal képezett oldatát hozzácsepegtetjük. A reakcióclegyet 2 óra múlva 300 ml vízmentes éterrel hígítjuk fs a fekete maradékról dekantáljuk. A maradékot háromszor kb. 50 ml vízmentes éterrel mossuk. A szerves fázisokat egyesítjük és az étert eltávolítjuk. A maradékot kovasavgélen kromatografáljuk és 9:1 arányú petroléter/etil-acetát eleggyel eluáljuk, 15 g cím szerinti vegyületet kapunk, kitermelés: 95%. Op.: 33—34 °C. c) Formil-metűén-trifenil-foszforán A cím szerinti vegyületet a J. Chem. Soc. 1961, i 266-1272 közlemény szerint állítjuk elő. d) 2-transz-hexadccenál 100 g (0,47 mól) tetradecenál, 173 g (0,56 mól) formil-metilén-trifenil-foszforán és 1 liter vízmentes kloroform elegyét 12 órán át visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraljuk. A reakcióelegyct lehűtjük, bepároljuk és a maradékot rövid kovasavgéloszlopon kromatogzalaijuk és petroléter (fp.: 35—80 °C) és etil-acetát 9:1 arányú elegyével eluáljuk a trifenil-foszfín-oxid eltávolítása céljából. A terméket nagy vákuumban ledesztilláljuk. A kapott vegyület Hoppe—Seyler: Z. Physiol. Chem. 354, 1626-1632 (1973) közleményében ismertetett termékkel azonos. Kitermelés: 77 g, 69%. Rf= 0,5 petróleumbenzin (fp.: 35—80 °C) és etilacctát 9 :1 arányú elegye. UV: ánizsaldehid-reagenssel (0,5 ml ánizsaldehid, 50 ml jégecet, 1 mi kénsav) kék színeződés; fp.: 115 C/ /0,133 Pa. e) 2-transz-oktadecenál 12 mg (50 millimól) hexadexenál és 15,2 g (50 millimól) formil-metilén-trifenil-foszforán 250 ml vízmentes toluollal képezett elegyét 8 órán át visszafolyató hűtő alkalmazása mellett forraljuk. A reakcióelegyet szárazra pároljuk. A maradékot ötször 100 ml éterrel extraháljuk. Az extraktumot szárazra pároljuk és a maradékot kova:avgélen kromatografáljuk és toluollal eluáljuk. 8,2 g cím rzerinti vegyületet kapunk, kitermelés: 62%. Öp.: 35 °C; Rf = 0,8 (8 :2 arányú toluol/etil-acetát elegy). ± 5
