195253. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid csoportba tartozó antibiotikumok előállítására mikrobiológiai úton és eljárás ezen antibiotikumokat tartalmzó állatgyógyászati készítmények előállítására
9 195253 10 U,5 g 20 g 0,3 g 4 g 30 ml halliszt melasz maleinsav dimetil-szulfoxid szójaolaj drammónium-hidrogén-foszfát 0,03 g kalcium-karbonát 1 g nátrium-klorid 1 g csapvíz 1000 mi re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészeteket síkrázógépen (260 fordulat/perc, 10 cm kitérés) 28°C-on 10 napig rázatjuk. Az antibiotikum termelés a fermentáció 84-96. órájában indul meg és a maximális értéket a 220—260. órában éri el. 10 15 A fermentáció befejezésekor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A stan- 20 dardra vonatkoztatva 3850 E/ml. (A meghatározást Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel végeztük.) A fermentlét 1% perlit hozzáadása után 25 leszűrjük, majd a sejteket kétszer 500 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóleveket egyesítve 5 liter 3000 E/ml aktivitású oldatot kapunk, melyet 750 ml Diaion HP-20 gyantából készült oszlopon (oszlopátmérő: 4 cm, 3Q gyantaágy magasság: 70 cm) folyatunk át. Ezután a gyantaágyat 250Ô ml vízzel, majd 1500 ml 20% aceton tartalmú vízzel mossuk. Ezt követően 1800 ml aceton-ecetsav-víz (9:1:40) eleggyel eluáljuk az antibiotikumo- 35 kát a gyantaoszlopról. Az eluálás során kapott mikrobiológiailag aktív frakciókat egyesítjük. Ezután az egyesített oldat pH-ját 8-rá állítjuk 8%-os nátrium-karbonát oldattal, majd az acetont csökkentett nyomáson 40 ledesztilláljuk. A kapott vizes bepárlási maradékból az antibiotikumokat kétszer 200 ml etil-acetáttal kivonjuk, majd az egyesített etil-acetátos extraktumot csökkentett nyomáson bepároljuk és a sűrítményből 20 ml n-pentán hozzáadásával leválasztjuk a tilozin-komplexet. Így 13 g, 85% tilozin A tartalmú tilozin - komplexhez jutunk. 2. példa 50 A Streptomyces tendae (MNG 00274) törzs spóráival beoltjuk az 1. példában megadott összetételű ferdeagar táptalajt. A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 106— 55 107/ml spórával steril körülmények között 500 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 100 ml steril táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő: kazein hidrolizátum (szárazanyag) 2 g glükóz 30 g nátrium-glutamát 2 g szójaolaj-pálmaolaj (1:1) 10 g ammónium-nitrát 5 g kalcium-karbonát 5 g csapvíz 1000 mi re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,2-ra állítjuk be. A tenyészetet síkzárógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on 2 napig rázatjuk, majd az így kapott tenyészet 4—4 ml ével 50 db 500 ml-es Erlenmeyer lombikban sterilizett 100—100 ml táptalajt oltunk be, melynek összetétele a következő: halliszt 10 g melasz 20 g kukoricakeményítő 5 g maleinsav 0,3 g dimetil-szulfoxid 4 g szójaolaj 31,5 g szójaliszt 5 g ammónium-hidrogén-foszfát 0,3 g kalcium-karbonát 2 g nátrium-klorid lg csapvíz 1000 ml-re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 28°C-on 10 napig rázatjuk. Az antibiotikum termelés a fermentáció 80—90. órájában indul meg és a maximális értéket a 230—250. órában éri el. A fermentáció befejezésekor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A standardra vonatkoztatva 3700 E/ml, Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel meghatározva. A fermentlét 1% perlit hozzáadása után leszűrjük, majd a sejteket kétszer 500 ml vízzel mossuk. A szűrletet és a mosóleveket egyesítve 5,1 liter 2900 E/ml aktivitású oldatot kapunk, melyet 750 ml Ambertite XAD-7 gyantából készült oszlopon (oszlopátmérő: 3,5 cm, gyantaágy magasság: 90 cm) folyatunk át 100—120 ml/óra sebességgel, majd a gyantaágyat 2000 ml vízzel és ezt követően 1500 ml, 20% aceton tartalmú vízzel mossuk. Ezután 2500 ml aceton-ecetsav-víz (9:1:40) eleggyel leoldjuk az antibiotikumokat a gyaniaoszlopról. Az eluálás során kapott mikrobiológiailag aktív frakciókat egyesítjük, ezután az egyesített oldat pH-ját 8-ra állítjuk 8%-os nátrium-karbonát oldattal, majd az acetont csökkentett nyomáson ledesztilláljuk. A kapott vizes bepárlási maradékból az antibiotikumokat kétszer 300 ml etil-acetáttal kivonjuk. Ezután az egyesített etil-acetátos extraktumot vákuumban bepároljuk és a sűrítményből 20 ml n-pentán adagolásával leválasztjuk a tilozin-komplexet. így 11 g, 83% tilozin A tartalmú tilozin-komplexhez jutunk. 3. példa A Streptomyces tendae (MNG 00274) törzs spóráival beoltjuk az 1. példában megadott összetételű ferdeagar táptalajt. A ferdeagar tenyészetet 8 napig inkubáljuk 37°C-on, majd a spórákat desztillált vízzel lemossuk. 10®— 107/ml spórával steril körülmények között 2000 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 500 ml 6
