195253. lajstromszámú szabadalom • Eljárás makrolid csoportba tartozó antibiotikumok előállítására mikrobiológiai úton és eljárás ezen antibiotikumokat tartalmzó állatgyógyászati készítmények előállítására
195253 12 11 steril táptalajt oltunk le a következő: szójaliszt kukoricalekvár glükóz szójaolaj lenolaj ammónium-nitrát kalcium-karbonát csapvíz be, melynek összetéte- 10 g 20 g 15 ml 15 ml 6 g 5 g 1000 ml-re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyészetet síkrázógépen (260fordulat/perc, 10 cm kitérés) 32°C-on, 2 napig rázatjuk. Az így kapott tenyészettel 10 literes üvegfermentorban lévő 5 liter steril táptalajt oltunk be, amelynek összetétele a következő: halliszt melasz maleinsav dimetil-szulfoxid szójaolaj diammónium-hidrogén-foszíát kalcium-karbonát nátrium-klorid csapvíz 11.5 g 20 g 0.3 g 4 g 30 ml 0,03 g 1 g 1 g 1000 ml-re. A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,3-ra állítjuk be. A tenyésztést keverés és levegőztetés közben 160—180 órán át folytatjuk. A tenyésztés hőmérséklete 28°C, a keverés fordulatszáma 400/perc, a levegőztetés 1/1 v/v. Habzásgátlóként 3A jelű habzásgátlót (gyártó: Chinoin, Budapest) használunk. Az antibiotikum termelés a fermentáció 60—72. órájában indul meg, a maximális értéket a 170, óra körül éri el. Ekkor a fermentlé összes antibiotikum tartalma tilozin A standardra vonatkoztatva — Staphylococcus epidermidis tesztorganizmussal, agardiffúziós módszerrel meghatározva — 3700 E/ml, A fermentáció befejezés után a fermentlevet (térfogat: 5 liter, pH 6—7) 1% perlit hozzáadása után lecentrifugáljuk. A kiülepedett sejteket 1 liter vízben felszuszpendáljuk és ismét lecentrifugáljuk. A felülúszókat egyesítjük és a kapott oldat pH-ját 8%-os nátrium-karbonát oldattal 8,5 értékre állítjuk, majd a tilozin-komplexet kétszer 2 liter etil-acetáttal kivonjuk. Az etil-acetátos kivonatokat egyesítjük, vízmentes nátrium-szulfáton megszárítjuk, majd csökkentett nyomáson, 50°C alatti hőmérsékleten 60 ml-re besűrítjük. Ezután az olajos sűrítményből 20 ml n-pentán hozzáadagolásával a hatóanyagot leválasztjuk. így 12,25 g nyers tilozin-komplexhez jutunk. A tilozin-komplex komponenseinek kromatográfiás elválasztása céljából 10 g nyers tilozin-komplexet 200 g szilikagélből (Kieselgel 40, Reanal, Budapest) készített oszlopon fokozatosan növekvő aceton-kloroform elegyekkel kromatografálunk. A tilozin A 20% aceton tartalmú kloroformmal oldódik le az 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 oszlopról. A tilozin A-t tartalmazó kromatográfiás frakciókból bepárlással 7 g kromatográfiásan tiszta tilozin A-hoz jutunk, melyet acetonból kristályosítunk át. Op.: 134—138°C [a]„= —50° (c=1, metanol) Infravörös színkép (KBr): vOH 3600—3200 (max. 3460), vC=0 1720 (észter C-l és aldehid C-20), 1670 (keton C-9) cm“1. Mágneses magrezonancia spektrum (CDCI3, Ô): 1,75 s (CH3 /H-22/), 2,5 s (N/CH3/2), 3,5 s, 3,6 s (OCH3), 5,8—6,4 (H-10, H-13), 7.3 d (H-ll), 9,6 (CHO /H-20/) ppm. Tömegspektrum: molekulatömeg (m/z): 915. A jellemző ionok (m/z): 915, 771, 581, 174, 132, 116, 111, 87, 83, 58, 44. A tilozin D 21% aceton tartalmú kloroformmal eluálódik az oszlopról. A tilozin D-t tartalmazó kromatográfiás frakciókat bepárolva 500 mg kromatográfiásan tiszta tilozin D-t kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át. Op.: 172—175°C [a]»= —49° (c=l. metanol) Infravörös színkép (KBr): vOH 3600—3100 (max. 3460), vC=0 1720 (észter C-l), 1675 (keton C-9) cm-1. Mágneses magrezonancia spektrum (CDCI3, Ő): 1,8 s (CH3 /H-22/), 2,5 s (N/CH3/2), 3.4 s, 3,55 s (OCH3), 5,5-6,5 (H-10 és H-13), 7,25 d (H-l 1 ) ppm. Tömegspektrum: molekulatömeg (m/z): 917. A jellemző ionok (m/z): 917, 190, 174, 173, 132, 87, 58. A tilozin C és a laktenocin 22% aceton tartalmú kloroformmal oldódik le az oszlopról, de kielégítően nem válik el egymástól. A tilozin C-t és a laktenocint tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban bepároljuk. így 680 mg tilozin C és laktenocin keverékhez jutunk, melynek komponenseit preparatív vékonyréteg-kromatográfiával választjuk el. A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztásnál adszorbensként szilikagélt (Kieselgel G (reanal, Budapest) és Kieselgel HF25,_366 (Peanal, Budapest) 2:1 arányú keveréke) és az alábbi kifejlesztő elegyeket alkalmazzuk: a.) etil-acetát-dietil-amin, 95:5; b.) kloroform-metanol-toluol, 80:17:23. A vékonyrétég-kromatográfiás elválasztással 260 mg tiszta tilozin C-t kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át. Op.: 134—138°C [a]= —53° (c=l, metanol) Infravörös színkép (KBr): vOH 3600-3100 (max. 3480), vC=0 1720 (észter C-l és aldehid C-20), 1670 (keton C-9) cm"1. Mágneses magrezonancia spektrum (CDCI3, ő): 1,8 s (CH3 /H-22/), 2,5 s (N/CH3/2), 3,45 s (OCH3), 5,5-6,5 (H-10, H-13), 7,25 d (H-ll), 9,6 (CHO /H-20/) ppm. A vékonyréteg-kromatográfiás elválasztás eredményeként 205 mg tiszta laktenocint kapunk, melyet acetonból kristályosítunk át. Op.: 121 —122°C. 7
