195251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új A80190 jelű antibiotikum származékai és ezeket tartalmazó gyógyhatású készítmények előállítására
11 195251 12 V. T Á B L Á Z A T (fo lytatás) tulaj donság NRRL 15878 A.macra zisztencia + • vizsgált fonákoldal szürke -5*' barna színe barna narancs oldható pigment barna barna spórafűzés RF RF spórafelszán sima sima növekedés hőmérséklettartománya 15-42° C 15-37 °C ureáz termêlés +spóra alakja elnyúj tott ovális spóraméret 0,5-0,7 x 0,8-1,0 x x 0,9-1 ,3 jum x 1,2-2,0jum Ez az összehasonlítás arra vall, hogy az 25 NRRL 15877 és az NRRL 15878 lényegesen különbözik más Actinomadura fajoktól, és egy új faj tagjai, melynek javasolt neve Actinomadura oligosporus sp. nov. A faj neve oligo= = kevés, sporus = spórát képez; oligospo- 30 rus = kevés spórát képző) a sporoforok viszonylagos hiányára utal. Az NRRL 15878 törzs az A. oligosporus típus törzse. Mint más mikroorganizmusok esetében is, a találmány A80180 antibiotikumot terme- 35 lő Actinomadura oligospora NRRL 15877 törzse változhat. Az ismert módszerekkel rekombinánsokhoz, mutánsokhoz vagy variánsokhoz juthatunk. így például mutánsok állíthatók elő a különféle fizikai és kémiai mutagén ke- 40 zelések alkalmazásával, mint amilyen az ultraibolya, röntgen- vagy gamma-besugárzás, vagy mutagén anyagokkal (N-metil-N’-nitro-N-nitrozo-guanidin) való kezelés. Az Actinomadura oligosporus NRRL 15877 45 természetes vagy indukált variánsai mutánsai, melyek megőrzik az A80180 termelő tulajdonságukat, a találmány oltalmi körébe tartoznak. Az Actinomadura oligosporus tenyésztésé- 50 re számos táptalajt használhatunk. A gazdaságos termelés, optimálisabb kinyerés és könynyebb elválaszthatóság szempontjából azonban vannak táptalajok, melyek előnyösebbek a többinél. így például nagyméretű fermentá- 55 ciónál előnyös szénhidrogénforrás a glükóz, noha ribózt, xilózt, fruktózt, galaktózt, mannózt, mannitot, burgonya dextrint és hasonlókat is használhatunk. Szénforrásként glicerint vagy lipideket használva, csak kissé vagy 60 egyáltalán nem fokozódik a növekedés és az antibiotikum termelés. Glükózzal kombinálva növekszik a sejttömeg mennyisége, de az antibiotikumtermelés csökken. Előnyös nitrogénforrás a kollagén-hidroli- gg zátum, de használhatunk enzim hidrolizálta kazeint, hús-peptont, hallisztett és hasonlókat is. A szervetlen tápsók közül, melyeket a táptalajba adunk, cink-, nátrium-, magnézium-, kálcium-, ammonium-, klorid-, karbonát-, szulfát-, nitrátionokat, stb. szolgáltató, oldható sókat használunk. A mikroorganizmus növekedéséhez és fejlődéséhez szükséges nyomelemeket ugyancsak kell tartalmaznia a táptalajnak. Ezek*az elemek általában a szükséges mennyiségben előfordulnak az egyes táptalajkomponensekben, mint szennyeződések. Habzással általában nem kell számolni, de a nagyméretű fermentációnál kis mennyiségű (azaz 0,2 ml/1) habzásgátlót, például propilén-glikolt adhatunk a táptalajhoz, ha szükséges. Jelentős mennyiségű A80190 antibiotikum termeléséhez az aerob, süllyesztett tankfermentáció az előnyös. Kis mennyiségű A80190 előállításához adott esetben rázott tenyészeteket is használhatunk. Minthogy a nagy fermentorok spórákkal történő oltásakor az antibíotikumtermelés egy lag-fázison megy át, előnyösebb vegetatív oltóanyagot használni. A vegetatív oltóanyagot úgy készítjük el, hogy kis térfogatnyi táptalajt a mikroorganizmus spóráival vagy micéliumtoredékeivel oltunk be. így friss, aktívan növekvő tenyészethez jutunk, ezt a tenyészetet visszük be a nagy fermentorokba. A vegetatív cltóanyag táptalaja megegyezhet a nagyméretű fermentáció táptalajával, de el is térhet attól. Az A80190 termelés 25-37°C hőmérséklettartományban lezajló növekedésnél történik, az antibiotikumtermelés szempontjából az optimális hőmérséklet a 30-32°C. Amint az a süllyesztett tenyészeteknél szokásos, a fermentor aljáról steril levegőt nyomunk át a tartályon miközben a tenyészetet a szokásos lapátos keverőkkel kevertetjük. Az eddig alkalmazott körülmények között a maximális oxigénfelvétel nem több, mint 0,2 mM/liter/perc. Egy 115 liter tenyészetet tartalmazó, terelőiemezes fermentornál, a percenként átnyomott levegő térfogatának a fermentlé 0,125 részét kell kitennie, percenként 200-as fordulatszámú kevertetésnél, hogy az oldat oxigérszintje a telítettségi szint 30%-a felett legyen. Az A80190 antibiotikum termelését a kivett minták biometriás mérésével követjük nyomon, az antibiotikumra érzékeny mikroorganizmust használva. A vizsgálatra alkalmas mikroorganizmusok egyike a Bacillus subtilis ATCC 6633. A biometriás mérésekhez a szokásos lyuggatott agarlemezes vizsgálatokat használjuk. Az A80190 antibiotikumot a fermentációs iparban szokásos eljárásokkal nyerjük ki. Az A80190 antibiotikum aktivitás a szűrt fermentlében és a micéliumban egyaránt jelentkezik. Az A80190 maximális kinyeréséhez ezért először szűréssel elválasztjuk a sejttömeget a fermentléből. Az A80190 antibiotikumot az-7
