195251. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az új A80190 jelű antibiotikum származékai és ezeket tartalmazó gyógyhatású készítmények előállítására
lépésnél is használt táptalajt. A beoltott táptalajt kétliteres, széles szájú Erlenmeyer lombikban rázatjuk 5,08 cm kitérésű, körkörös rázógépen, percenként 250-es fordulatszámmal, 30°C hőmérsékleten, 48 órán keresztül. 800 ml fentiek szerint előállított második lépéses vegetatív tenyészettel oltunk be 100 liter steril, az A) pontban ismertetett, termelő táptalajt. A beoltott táptalajt 165 literes, keverővei ellátott fermentorban fermentáljuk 30-32°C hőmérsékleten, 8-10 napon keresztül. A lassú levegőadagolás (percenként a tenyészet térfogatának 0,12-0,25 része) és az alacsony fordulatszám (percenként 150-200) az oldott oxigén koncentrációját a levegőtelítettség 30%-a felett tartja. 2. példa Az A80190 kinyerése: két fermentor egyesített fermentlevét (207 liter) Hyflo Supercel hozzáadását követően présszürőn szűrjük. A kiszűrt micéliumtömeget 40 liter metanol cirkuláltatásával extraháljuk a présszűrőn. Az extraháláshoz acetont is használhatunk. A metanolos extraktumot csökkentett nyomáson 15 literre pároljuk, és egyesítjük a 182 liter fermentlészűrlettel. Az oldat kémhatását In nátrium-hidroxid oldattal pH=9 értékre állítjuk be, és azonos térfogatnyi etil-acetáttal extraháljuk. Az etil-acetátos extraktumot 700 ml-re töményítjük, 1 liter vizet adunk hozzá, a kémhatást nátrium-hidroxid oldattal pH=9 értékre állítjuk, és ezt a kémhatást tartva, kétszer 1 liter toluollal extraháljuk. A toluolos extraktumokat egyesítjük, és csökkentett nyomáson bepároljuk, olajos bepárlási maradékot nyerve. A maradékot 100 ml toluolban oldjuk, és 2 liter szilikagélből (Woelm, 0,105-0,205 mm) álló, toluol-ágyas oszlopra visszük. Az oszlopot 10 liter toluollal, 10 liter toluol/etanol 49:1 arányú elegyével és végül 10 liter toluol/etanol 48:2 arányú elegyével eluáljuk, egy literes frakciókat gyűjtve. Az eluciót biológiai vizsgálattal és vékonyréteg-kromatográfiával kísérjük nyomon. Az A80190-et tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot dioxánban oldjuk, és fagyasztva szárítjuk, 13,6 g nyers A80190-et nyerve. 3. példa Az A80190 tisztítása: az I. és 2. példában leírtak szerint 4 fermentorból kapott 20,4 g nyers A80190-et feloldunk 200 ml acetonitrilben. Az oldatot szilikagél oszlopra visszük, amit acetonitrilben készítünk 2 liter szilikagélből (Woelm, 0,105-0,205 mm). Az oszlopot 10 liter acetonitrillel mossuk, majd az alábbi összetételű és térfogatú acetonitril/aceton eleggye! eluálunk: 95:5, 2 liter; 9:1, 10 liter; 4:1, 10 liter és 7:3, 10 liter. Egyliteres frakciókat gyűjtünk. Az eluálást biológiai vizsgálatokkal követjük nyomon, Bacillus subtilist használva. Az A80190-et tartalmazó frakciókat egyesítjük és bepároljuk. A maradékot 21 12 dioxánban oldjuk és fagyasztva szárítjuk, 15,8 g tisztított A80190-hez jutva. 4. példa Az A80190 kristályosítása: 28,2 g tisztított A80190-et feloldunk 500 ml acetonban. 500 ml vizet adunk hozzá és az oldat kémhatását híg sósavval pH=5,0 értékre állítjuk be. Az oldatot szobahőmérsékleten hagyjuk állni 20 órán keresztül, mialatt megtörténik a kristályosodás. A kristályokat szűréssel elválasztjuk, vízzel mossuk és csökkentett nyomású szárítószekrényben szárítjuk, 25,9 g kristályos A80190-et (savas forma) nyerve. Az A80190 kloroformban felvett infravörös abszorpciós spektrumát az 1. ábrán mutatjuk be. 5. példa Az A80190 nátriumsójának előállítása: 300 mg savformában lévő A80190-et 30 ml acetonban oldunk, 10 ml vizet adunk hozzá, és az oldat kémhatását nátrium-hidroxid oldattal pH=10 értékre állítjuk be. Az oldatot olajos maradékig töményítjük, amit dioxánban oldunk, és fagyasztva szárítunk, amorf fehér porhoz jutva (op.: 145-150°C). A „field-deszorpciós" tömegspektrometria (FDMS) szerint a termék molekulatömege: 850. IR (CHCI3) 2962, 2934, 2885,2825, 1719, 1569, 1455, 1397, 1377, 1358, 1314,1285, 1243, 1162, 1104, 1074, 1057, 1025, 987, 979, 936, 922, 895 és 847 cm~‘ (2. ábra). 6. példa Az A80190 nátriumsójának előállítása (alternatív eljárás): 5 g savas formában levő A80190-et 500 mg etil-acetátban oldunk és 500 ml vizet adunk hozzá. Az oldat kémhatását 5n nátrium-hidroxid oldattal pH=10 értékre állítjuk be, és a kémhatást megtartva 15 percen keresztül kevertetjük. Az etil-acetátos fázist elválasztjuk, 500 ml vízzel mossuk és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot 100 ml dioxánban oldjuk, és fagyasztva szárítjuk, 4,1 g A80190-nátriumsót nyerve. A mosóvizet hagyjuk szobahőmérsékleten állni egy éjszakán Keresztül, a kivált kristályokat kiszűrjük és szárítjuk. A kapott kristályos anyag savformában levő A80190 (op.: fl5-120°C). 7. példa A 80190-nátriumsó kristályosítása: 1 g A80190-nátriumsót feloldunk 10 ml pentánban és szobahőmérsékleten hagyjuk áfini három napon át (az oldószer 5 ml-re párlódik). A keletkezett kristályokat kiszűrjük, csökkentett nyomáson szárítjuk, 593 mg kristályos A80190-nátriumsót kapva. Op.: 225-230°C. 8. példa A mono-acetil-A80190 előállítása: 200 mg (savformában levő) A80190-et4 ml piridinben oldunk, 4 ml ecetsavanhidridet adunk hozzá. 22 195251 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
