195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 baktériumok vagy más, fertőző tényezők hatását. Például a higromicin B vagy a G418 rezisztencia géneket különvkülön vagy kombinálva beépíthetjük egy sejtvonalba vagy korai, embrionális sejtbe, amikor olyan többsejtű organizmushoz jutunk,- amely ezekre az antibiotikumokra rendkívül rezísztens. így a rezisztens többsejtű varietász, például a sertés, marha vagy juh tolerálni képes annak a nagykoncentrációjú antibiotikumnak a jelenlétét, amely alkalmas lassú növekedést és csökkent életképességet okozó paraziták és fertőző betegséget okozó ágensek kontrollálására. Az alábbiakban részletes példákkal szemléltetjük a találmány szerinti eljárást. I. példa A pKC203 plazmid A) A plazmid dezoxi-ribonukleinsav izolálása az E. coli JR225 sejtből Az E. coli JR225 (ATCC 31912) baktériumot TY táptalajban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő: 1% tripton, 0,5% élesztőkivonat, 0,5% nátrium-klorid, pH-ja = 7,4. A táptalajt ml-enként 100 pg higromicin B antibiotikummal egészítjük ki. A tenyésztést a hagyományos mikrobiológiai módszerek szerint végezzük. 18 órán át inkubáljuk a tenyészetet, majd 0,5 ml tenyészetet 1,5 ml térfogatú Eppendorf-csőbe helyezünk és 15 másodpercen át centrifugáljuk. Az összes tevékenységet — kivéve, ha másként nem adjuk meg — szobahőmérsékleten végezzük. A felülúszót óvatosan eltávolítjuk, és a sejtüledéket 100 pl frissen előállított lizozimes oldatban szuszpendáljuk. Az oldat 2 mg/ml lizozimot, 50 mmól glükózt, 10 mmól ciklohexán-diamino-tetraacetátot és 25 ml trisz-hidrogén-kloridot tartalmaz (pH= =8,0). 30 percen át 0°C hőmérsékleten inkubáljuk a szuszpenziót, majd 200 pl alkalikus nátrium-dodecil-szulfát-oldatot adunk (0,2 n nátrium-hidroxid, 1% nátrium-dodecil-szulfát). A csövet enyhén vortexeljük, majd 15 percen át 0°C hőmérsékleten tartjuk. Ezután 150 pl 3 mólos nátrium-acetát-oldatot adagolunk. Az oldatot úgy állítjuk elő, hogy a lehető legkisebb mennyiségű vízben 3 mól nátrium-acetátot oldunk, az oldat pH-ját jégecettel 4,8-ra állítjuk be, majd térfogatát 1 l-re egészítjük ki. Ezután enyhén rázogatjuk a csőben lévő oldatot, ezalatt létrejön a dezoxi-ri bonukleinsav-csapadék. 60 percen át 0°C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd 5 percen át centrifugáljuk, amiután majdnem teljesen átlátszó felüI- úszót kapunk. 0,4 ml felülúszót egy másik centrifuga csőbe teszünk, az oldatot 1 ml hideg etanollal egészítjük ki. 30 percen át —20°C hőmérsékleten tartjuk a készítményt, amiután centrifugálással (2 perc) elkülönítjük a csapadékot. A felülúszót leszfvatjuk. Az így kapott üledéket 100 pl, 0,1 mólos nátrium-acetát/0,05 mól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8) elegyben oldjuk, és két térfogat- 8 13 nyi etanollal újra kicsapjuk! 10 percen át 20°C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, a csapadékot centrifugálással az előbbiek szerint elkülönítjük. Ez a csapadék tartalmazza az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleínsavat. B) Az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukieinsav transzformálása és a pKC203 plazmid izolálása Az E. coli JR225 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 100 pl 0,1 mólos nátrium-acetát/ /0,5 mól trisz-hidrogén-klorid (pH = 8) elegyben oldjuk, majd ezt követően két térfogatnyi hidegetanollal kicsapjuk. A kapott plazmid dezoxi-ribonukleinsavat összegyűjtjük és 40 pl vízben oldjuk, az oldatot pufferral hígítjuk, oldjuk Wensink módszere szerint (Cell, 3, 315, 1974) E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk. Az E. coli K12 BE827 sejteket az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland) törzsgyüjteményében letétbe helyeztük; innen ATCC 31911 számon elkérhető. A transzformánsokat TY-agaron szelektáljuk. Az agar 1% triptont, 0,5% élesztőkivonatot, 0.5% nátrium-kloridot, 1,5% agart és ml-enként 200 pg higromicin B antibiotikumot tartalmaz, pH-ja = 7,4. A gélelektroforézises vizsgálat (Rao és Rogers, 1978) és más vizsgálatok szerint egyes transzformánsok nagy és kisebb (15 kb) plazmidokat tartalmaznak, és rezisztensek ampicillinre és higromicin B-re. Más transzformánsok csak a kisebb, 15 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák, és a higromicin B és a G418 antibiotikumokra rezisztensek, szenzitivek azonban ampicillinre. Az utóbbi típusú transzformánsokat ml-enként I mg higromicin B-t tartalmazó TY-agaron szélesztjük, és a hagyományos mikrobiológiai techn.ka szerint tenyésztjük. A sejteket az 1A. példa szerint eljárva felhasználjuk a fenti 15 kb nagyságú higromicin B és G4I8 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó plazmid izolálására. Ezt a plazmidot a továbbiakban pKC203 jellel jelöljük. A pKC203 plazmidon jelenlévő, higromicin B és G4I8 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gének jelenlétét a továbbiakban transzformációs és szelekciós analízissel bizonyítjuk. 2. példa A higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó gének és szabályozó elemek izolálása 5 pg pKC203 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat a gyártó cég által megadott körülmények között Bglll restrikciós enzimmel kezelünk (a restrikciós enzimeket és használatuk módját az alábbi cégektől kaphatjuk meg: Bethesda Reserarch Laboratories Inc., Box 6010, Rockville, Maryland 20850.; Boehringer Mannhein Biochemicals 7941 Castleway Drive, P.O. Box 50816, Indianapolis, Indiana, 46250.; New England Bio Labs., Inc., 283 Cabot, 14 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
