195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 Beverly, Massachusetts 01915.; Research Products, Miles Laboratories Inc., Elkhart, Indiana 46515.). A 7,5 kb, 5,8 kb és 0,5 kb nagyságú fragmensek közül a 7,5 kb nagyságú BglII fragmens tartalmazza a higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó géneket és szabályozó elemeket. Ezt transzformációs és szelekciós analízissel bizonyítjuk, a kísérletek azt mutatják, hogy a közönséges körülmények között a higromicin B-re és a G418-ra érzékeny sejtek a 7,5 kb nagyságú BglII fragmenssel való transzformációt követően rezisztensekké válnak. 3. példa A pKC214 és a pKC215 plazmidok előállítása és az E. coli K12 BE827/pKC214 és az E. coli K12 BE827/pKC215 tarnszformánsok A pSV5 gpt plazmid előállítását Mulligan és Berg írja le (Science, 209, 1422, 1980), a plazmid a gpt génen belül egyetlen BglII hellyel rendelkezik. Az alábbiak szerint klónozva kifejezzük a higromicin B és G418 rezisztencia géneket. 5 pg pSV5 gpt plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az előállító cég ajánlását követve BglII restrikciós enzimmel kezelünk (lásd előbb). Az enzim inaktiválására 5 percen át 70°C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd 1:1 arányban 1 pg dezoxi-ribonukleinsavat keverünk a pKC203 7,5 kb nagyságú BglII fragmensévei. A fragmenseket T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal kapcsoljuk össze, a kísérletet az előállító ajánlása szerint végezzük (Bethesda Research Laboratories, Box 6010, Rockville, Maryland 20850.). A ligációs eleggyel E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk TY lemezeken, amelyek 100 pg/ml ampicillint és apramicint tartalmaznak. A transzformációt Wensink szerint végezzük (Cell, 3, 315, 1974). A rekombináns kiónokat 100 pg/ml ampicillint és 200 pg/ml higromicin B-t tartalmazó TY-lemezeken szélesztjük. A higromicin B rezisztens rekombináns kiónok körülbelül fele tartalmazza a pKC214 plazmidot (lásd. 3. ábra), míg a többi sejt a pKC215 plazmidot hordozza (lásd 4. ábra). A fenti klónokból.származó különböző plazmid dezoxi-ribonukleinsavat az 1A. példa szerint eljárva izoláljuk, és restrikciós enzim-analízissel ismert módon vizsgáljuk. Ilyen módon a pKC214 és pKC215 plazmidokat és az előállított E. coli K12 BE827/pKC214 és E. coli K12 BE827/pKC215 transzformánsokat azonosítjuk és további felhasználásra izoláljuk. 4. példa A Mouse Ltk~/pKC214 előállítása A Mouse Ltk- sejteket ismert módon tenyésztjük olyan táptalajon, amely minimál 15 esszenciális táptalajt tartalmaz Earle-sókkal és npm esszenciális aminosavakkal együtt (Eagle, Science, 130, 432, 1959). A táptalaj 10% újszülött borjúszérumot és ml-enként 292 pg glutamint is tartalmaz. A tenyésztett Mouse Ltk- sejteket transzformáljuk a pKC214 plazmiddal Wigler és munkatársai szerint eljárva (Proc. Nat. Acad. Sei., USA, 76, 1373, 1979). A transzformációt a fentiek szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy mindegyik lemezhez 1 ml kalcium-foszfát-csapadékban 100-300 mg plazmid dezoxi-ribonukleinsavat adunk, továbbá a tenyésztő táptalaj a fentiekben megadottal azonos. Négy órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk a tenyészetet, majd a táptalajt friss táptalajjal cseréljük ki, és további 20 órán át folytatjuk az inkubálást. Ekkor higromicin B antibiotikum szelekciós nyomást biztosítunk. Ezt úgy végezzük, hogy a táptalajt olyan szelekciós táptalajjal cseréljük ki, amely a fenti összetételű, de ezenkívül ml-enként 75-1000 pg higromicin B-t tartalmaz. A szelekciós táptalaj előnyös antibiotikum-koncentrációja 200 pg/ml. Az első nap után cseréljük a szelektív táptalajt, majd a második napon ismét, végül az elkövetkező 2-3 hétig minden harmadik napon. Ezalatt megjelennek a transzformáns kiónok. összegyűjtjük a telepeket, és nagytömegű tenyész-sejtet állítunk elő, miközben fenntartjuk a szelekciós nyomást. Az így kapott higromicin B antibiotikumra rezisztens sejtek a Mouse Ltk-/ /pKC214 transzformánsok. 5. példa A Mouse Ltk~/pKC2I5 előállítása A 4. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a Mouse Ltk~/pKC215 sejteket, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pKC215 plazmidot használunk a transzformációs eljárás során. Az előállított Mouse Ltk~/pKC215 transzformánsokat szaporítjuk. 16 6. példa A transzformánsok rezisztenciája a higromicin B és G418 antibiotikumokkal szemben Annak bizonyítására, hogy a pKC203, pKC214 és pKC125 plazmidok meghatározzák a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát, a transzformált és nem transzformált E. coli és Mouse Ltk- sejteket különböző mennyiségű antibiotikumokat tartalmazó táptalajon növesztjük. Az E. coli és Mouse Ltk- sejtek tenyésztéséhez használt táptalajok gyakorlatilag azonosak az 1A. és 4. példában megadott táptalajokkal. A kísérletek eredményeit az 1. és 2. táblázatban adjuk meg, a táblázatban: a 4- növekedést jelez; a — jel a növekedés hiányát jelzi; az N/T betűjelek pedig a vizsgálat hiányát mutatják. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
