195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 teket higromicin jelenlétében tenyésztünk és a tenyészetből izoláljuk a plazmid DNS-t, az izolált plazmid DNS-sel E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli K12 BE827 sejteket higromicin B jelenlétében tenyésztjük, a higromicin B és G418 antibiotikumokra rezisztens és ampicillinre érzékeny transzformánsokat szelektáljuk, végül a 15 kb nagyságú plazmidot a sejtekből izoláljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.) 2. Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó két különböző strukturgént és a hozzájuk kapcsolódó szabályozó szekvenciát hordozó, prokarióta sejtekben funkcionáló pKC222 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy az I. igénypont szerint előállított plazmidot BglII és Sáli restrikciós enzimekkel kezeljük, a keletkezett 2,75 kb nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk és Sall-el és BglII-vel kezelt pKC7 plazmiddal ligáljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.) 3. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó, két különböző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pKC203 plazmidot a) BglII restrikciós enzimmel kezeljük, majd a 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós fragmenst izoláljuk vagy b) BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük és a 2,75 kb nagyságú SálI/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22.) 4. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni szekvenciát meghatározó, két különböző strukturgént és az ehhez tartozó szabályozó szekvenciát tartalmazó DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a pKC222 plazmidot a) BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük és a mindkét antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 2,75 kb nagyságú Sall/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk vagy b) BglII és SacI restrikciós enzimmel kezeljük és a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 1,51 kb nagyságú SacI/BglII restrikciós fragmenst izoláljuk, vagy c) Sáli és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük és a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall restrikciós fragmenst izoláljuk. (Elsőbbsége: 1981.06.22j 5. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát mutató, a 3. vagy 4. igénypontok szerint előállított restrikciós fragmensek vagy származékaik bármelyikét tartalmazó, prokarióta sejtekben funkcionáló alá-bbi plazmidok: 33 18 a) pSC701, b) pKC257, c) pKC259, d) pKC261, e) pKC275 és f) pKC264, előállítására, azzal jellemezve, hogy a) a 3a) igénypont szerint előállított 7,5 kb nagyságú BglII fragmenst DNS ligázzal kezeljük, majd b) az a) eljárás során kapott pSC701 plazmidot HaelII restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, a keletkezett plazmidok elegyével E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli K12 BE783 sejteket higromicin B jelenlétében tenyésztjük, a higromicin B-re rezisztens transzformánsokat szelektáljuk és a 4,2 kb nagyságú plazmidot a sejtekből izoláljuk, majd c) a b) eljárás során kapott pKC257 plazmidot Sau3 AI restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, majd d) a c) eljárás során kapott pKC261 plazmidot és a pUR222 plazmidot külön-külön Haell restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk, vagy e) az a) eljárás során kapott pSC701 plazmidot HaelII restrikciós enzimmel kezeljük, és a kapott fragmenst DNS ligázzal kezeljük, a keletkezett plazmidok elegyével E. coli K12 BE783 sejteket transzformálunk, a transzformált E. coli KI2 BE783 sejteket higromicin B jelenlétében tenyésztjük, a higromicin B-re és apramicinre rezisztens transzformánsokat szelektáljuk és az 5,0 kb nagyságú plazmidot izoláljuk, majd f) az e) eljárás során kapott pKC259 plazmidot és az YEp24 plazmidot külön-külön EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük és a kapott fragmenseket egymással ligáljuk. (Elsőbbsége: 1982.03.26J 6. Eljárás a higromicin B és G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát mutató, a 3. vagy 4. igénypontok szerint előállított restrikciós fragmensek vagy származékaik bármelyikét tartalmazó, prokarióta és eukarióta sejtekben funkcionáló alábbi plazmidok: a) pKC214 és pKC215, b) pGDIO és pGDl 1, c) pGD12 és pGD13, és d) pGD14 és pGD15 előállítására, azzal jellemezve, hogy a) a 3a) igénypont szerint előállított 7,5 kb nagyságú BglII fragmenst BglII-vel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy b) a 4b) igénypont szerint előállított 1,51 kb nagyságú SacI/BglII fragmenst BglII kapcsolókhoz kapcsoljuk és az így nyert terméket BglII restrikciós enzimmel kezelt pSV5 gpt plazmiddal ligáljuk, vagy c) a 4c) igénypont szerint előállított 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmenshez BglII kapcsolókat kapcsolunk és a kapott. 34 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
