195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
19 195248 20 9. példa A Saccharomyces cerevisiae/pGD2 előállítása A 8. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pGDl plazmid helyett a pGD2 plazmidot használjuk. 10. példa A pGD3 és a pGD4 plazmidok, és az E. coli KI2 BE827/pGD3 és az E. coli KI2 BE827/ /pGD4 transzformánsok előállítása A p04 plazmid előállítását Solnick írja le (Cell, 24, 135, 1981), a plazmid tartalmazza az Adenovirus 2 (Ad 2) késői promoterét a 15,4 (EcoRI) és 16,6 (HindlII) térképszakaszok között. A 7,5 kb nagyságú pKC203 Bglll plazmid fragmenst beépítve a p04 plazmid HindlII helyébe, kifejeződik a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó gén. A kísérletet úgy végezzük el, hogy Ullrich- és munkatársai szerint (Science, 196, 1313, 1977) a 7,5 kb nagyságú Bglll fragmenshez HindlII linkereket ( [d(CCAAGCTTGG) j, Collaborative Research Inc., 1365 Main Street, Waltham, MA 02154.) adunk, majd az így módosított fragmenst T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal hozzákapcsoljuk a HindlII enzimmel kezelt p04 plazmidhoz. A HindlII restrikciós enzimet és a T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázt a 2. és 3. példában ismertetett cégektől vásároltuk, használatukkor az eladó tanácsait követtük. A 7,5 kb nagyságú Bglll fragmens HindlII linkerekkel való ellátását követően a fragmenst a p04 plazmidhoz kötjük, amikor megkapjuk a pgD3 és a pGD4 plazmidokat. A kísérletet lényegében a 3. példában megadottak szerint végezzük. Az E. coli K12 BE827 sejteket transzformálva megkapjuk az E. coli K12 BE827/pGD3 és az E. coli K12 BE827/ /pGD4 transzformánsokat. A transzformációt a 3. példában megadottak szerint végezzük. Mint ahogy azt a 3. és 7. példában ismertettük, a beépített, rezisztenciát meghatározó fragmens orientációjától függően kétféle orientációjú plazmidot kapunk. A pGD3 jelű rekombináns plazmidban a Sáli restrikciós hely a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó fragmensben az Ad2 promoter EcoRI helyéhez közelebb esik. A pGD4 jelű plazmidokban az orientáció fordított. 11. példa A Mouse Ltk~/pGD3 előállítása A Mouse Ltk^/pűDS előállítására a 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD3 plazmidot használjuk. 12. példa A Mouse Ltk~/pGD4 előállítása A Mouse Ltk~/pGD4 előállítására a 4. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a pKC215 plazmid helyett a pGD4 plazmidot használjuk. 13. példa A pKC222 plazmid és az E. coli K12 BE827/ /pKC222 transzformáns előállítása A) A pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sáli/ /Bglll fragmensének izolálása 5 ng pKC203 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat Sáli és Bglll restrikciós enzimmel kezelünk, az előállító intsrukciói szerint eljárva (lásd a 2. példát). A higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító géneket és szabályozó elemeket tartalmazó 2,75 kb nagyságú fragmenst ismert módon különítjük el. B) Ligálás és végső előállítás 5pg, Rao és Rogers szerint kapott pKC7 plazmidot (Gene, 7, 79, 1979) Sali és Bglll restrikciós enzimekkel kezelünk. Az enzimeket 70°C hőmérsékleten 5 percen át tartva a reakcióelegyet inaktiváljuk, majd ezt követően 1:1 arányban 1 pg dezoxi-ribonuklein.savat keverünk a pKC203 2,75 kb nagyságú SalII/BglII fragmensével. T4 dezoxi-ribonukleinsav-ligázzal összekapcsoljuk a fragmenseket, a reakciót az enzimet előállító tanácsai alapján végezzük (lásd a 3. példát). A kapott pKC222 plazmiddal E. coli K12 sejteket transzformálunk, a 3. példában megadottak szerint eljárva. A sejtek az ampicillin, higromicin B és G418 antibiotikumokkal szemben rezisztensekké válnak. 14. példa A pKC222 plazmid higromicin B rezisztenciát meghatározó, 1,51 kb nagyságú Sac 1/ /Bglll fragmensének izolálása A 13A. példában megadottak szerint izoláljuk a kívánt dezoxi-ribonukleinsav-fragmenst, azzal a különbséggel, hogy az Sáli enzim helyett SacI és Bglll restrikciós enzimeket használunk. 15. példa A pKC222 plazmid G418 rezisztenciát meghatározó, 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sali fragmensének izolálása A 13A. példában megadottak szerint izoláljuk a kívánt dezoxí-ribonukleinsav-fragmenst, azzal a különbséggel, hogy a Bglll enzim helyett EcoRI és Sáli restrikciós enzimekkel végezzük az emésztést. 16. példa A pGDIO és pGDll plazmidok és az E. coli KI2 BE827/pGD10 és E. coli K12 BE827/ /pGDll transzformánsok előállítása A 3. és 10. példában megadottak szerint eljárva állítjuk elő a kívánt plazmidot, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú Bglll fragmense helyett a pKC222 plazmid 1,51 kb nagyságú SacI/BglII fragmensét és a HindlII helyett Bglll linkereket kötünk az antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmenshez. Az II 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
