195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 1,51 kb nagyságú, BglII linkereket hordozó fragmenst a pSV5 gpt plazmidba építjük be,a beépítést a 3. példában megadottak szerint végezzük. Ahogy azt a 3. és 7. példában megadott eljárás során ismertettük, a plazmidok két orientációban léteznek, attól függően, hogy a beépített antibiotikum rezisztenciát hordozó fragmens hogyan helyezkedik el. A pGDIO jelű rekombináns plazmidokban a beépített higromicin B rezisztenciát meghatározó fragmens Aval restrikciós helye közelebb esik a gpt gén HindllI helyéhez. A pGDll plazmidban a fragmens orientációja fordított. Ezután a 3. példában megadottak szerint eljárva a pGDIO és a pGDll plazmidokat E. coli K12 BE827 sejtekbe transzformáljuk, amikor sorrendben megkapjuk az E. coli K12 BE827/pGD10 és az E. coli KI2 BE827/pGDll transzformánsokat. 17. példa A Mouse Ltk~/pGD10 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pGDIO plazmidot használunk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk“/pGD10 sejteket tömegesen tenyésztjük. 18. példa A Mouse Ltk"/pGDll előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGDll plazmidot használjuk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk“/pGDll sejteket tömeges tenyésztéssel szaporítjuk. 19. példa A pGD12 és a pGD13 plazmidok, és az E. coli K12 BE827/pGD12 és az E. coli K12 BE827/ /pGDI3 transzformánsok előállítása Lényegében a 3. és 10. példában megadottak szerint járunk el a fenti plazmidok előállítására, azzal a különbséggel, hogy a pKC203 plazmid 7,5 kb nagyságú BglII fragmense helyett a pKC222 plazmid 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall fragmensét használjuk, és a HindllI linkerek helyett BglII linkereket kötünk a fragmenshez, amely fragmens az antibiotikum rezisztenciát határozza meg. Az 1,65 kb nagyságú BglII linkereket hordozó fragmenst a pSV5 gpt plazmidba építjük be, a 3. példában megadottak szerint eljárva. Ahogy azt a 16. példában megadtuk, a plazmidok két orientációban léteznek. A pGDI2 jelű rekombináns plazmidokban a beépített G418 antibiotikum rezisztenciát hordozó fragmens PstI restrikciós helye közelebb van a gpt gén HindllI helyéhez. A pGD13 jelű plazmidokban az orientáció fordított. A kapott pGD12 és a pGD13 plazmidokkal E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, a 3. példában megadottak szerint 21 12 eljárva, az E. coli K12 BE827/pGD12 és az E. coli K12 BE827/pGD13 előállítására. Az eljárás során a higromicin B-vel való transzformáns szelekció helyett G418 antibiotikumra szelektálunk. 20. példa A Mouse Ltk~/pGD12 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunK el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett pGDI2 plazmidot használunk a transzformáció során, továbbá a transzformánsok szelektálását nem higromicin B-vel, hanem G418 antibiotikummal végezzük A kapott Mouse Ltk_/pGD12 sejteket tömeges tenyészetben növesztjük. 21. példa A Mouse Ltk~/pGD13 előállítása Az előállítást a 4. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD13 plazmidot használjuk a transzformáció során, a transzformánsok szelektálását pedig nem higromicin B-vel, hanem G418 antibiotikummal végezzük. A kapott Mouse Ltk_/pGD13 sejteket tömeges tenyészetben növesztjük. 22 22. példa A pGD14 és a pGD15 plazmidok, és az E. coli K12 BE827/pGD14 és az E. coli K12 BE827/ /pGD15 transzformánsok előállítása A pKC203 plazmid 2,75 kb nagyságú Sáli/ /BglII fragmensét a 13. példában megadottak szerint eljárva izoláljuk. Ezután a 10. példában megadottak szerint, molekuláris linkereket kapcsolunk hozzá, azzal a különbséggel, hogy nem HindllI, hanem BglII linkereket használunk. A fragmenst ezután a pSV5 gpt plazmidba építjük be, a beépítést a 3. példában megadottak szerint végezzük. Ahogy azt a 16. példában megadtuk, két orientációjú plazmidot kapunk. A pGD14 jelű rekombináns plazmidokban az antibiotikum rezisztenciát meghatározó fragmens Aval restrikciós helye közelebb esik a gpt gén HindllI helyéhez. A pGD15 plazmidok fordított orientációjúak. Ezután a 3. példában megadottak szerint eljárva, a pGD14 és a pGD15 plazmidokkal E. coli K12 BE827 sejteket transzformálunk, amikor megkapjuk az E. coli K12 BE827/pGD14 és az E. coli K12 BE827/ /pGD15 transzformánsokat. 23. példa A Mouse Ltk~/pGD14 előállítása A 4. példában megadottak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a pKC214 plazmid helyett a pGD14 plazmidot használjuk a transzformáció során. A kapott Mouse Ltk“/pGD14 sejteket tenyészetben növesztjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
