195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 A találmány tárgya eljárás eukariota és prokariota sejtekben kifejeződő higromicin Elvei és G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát biztosító, új rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok előállítására. A találmány tárgya továbbá a fenti vektorok transzformánsainak előállítása. A találmány szerinti eljárás különösen fontos, mivel alkalmazásával megoldhatjuk a klónozott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák azonosítását, az azokkal való tevékenységet és stabilizálást, abban az esetben is, ha eukariota és prokariota sejtekben nem rendelkeznek szelektálható funkcióval. Ezideig az eukariota sejtekben kivitelezett rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia fejlődése és lehetőségeinek kihasználása lassú volt és nehéz, a következő okok miatt: 1) Olyan megfelelő klónozó vektorok hiánya, amelyek eukariota sejtekben szelektálható markereket tartalmaznak; 2) az adott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciákat eukariota sejtekben nem voltunk képesek gyorsan sokszorosítani; végül 3) az eukariota sejttenyészetekben lévő sejtek lassú generációs ideje. Ügy találtuk, hogy a fenti nehézségeket egy olyan rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorral megoldhatjuk, amely tartalmaz: a) egy eukariota promotert, b) egy vagy két különböző strukturgént, és az ezzel összefüggő szabályozó szekvenciát, ezek biztosítják a higromicin B és a G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát olyan gazdasejtbe transzformálva, amely az egyik vagy mindkét antibiotikummal szemben érzékeny; ez a gazdasejt képes transzformálódni, osztódni és tenyésztődni; c) egy prokariota replikont, amely funkcionális az adott prokariota gazdasejtben, azzal a feltétellel, hogy az egyik vagy mindkét strukturgén és a hozzá kapcsolódó kontroll (szabályozó) szekvencia szomszédos egymással, továbbá, amely eukariota gazdasejtben az eukariota promoterről íródik át, és egy egyedülálló gén és a hozzákapcsolódó szabályozó szekvencia a higromicin B és a G418 antibiotikumok közül az egyikkel, de nem mindkettővel szembeni rezisztenciát biztosít, és a G4I8 antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó szakaszt hordozó gén nem határozza meg a foszfo-transzferáz enzimet; az adott vektor funkcionál és szelektálható mind eukariota, mind pedig prokariota sejtekben. Ebből kövelkezik, hogy a fent ismertetett, sokoldalú vektorokba klónozott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák hagyományos módon kezelhetők és sokszorosíthatók prokariota sejtekben, ezzel elkerüljük az eukariota sejtekkel való kényelmetlen és nehézségekkel teli munkát. Ezenfelül, mivel a találmány szerinti vektorok funkcionálnak és szelektál- 2 1 hatók eukariota sejtekben is, ezek a velük kivitelezett kísérletek és sokszorosításuk után közvetlenül eukariota gazdasejtekbe transzformálhatok, anélkül, hogy tovább modósí- 5 tanánk azokat. Ez nem csupán előnyös, áe jelentős előrehaladást jelent a génsebészeti technikában. A dezoxi-ribonukleinsav klónozása eukariota gazdasejtekbe és a tarnszformánsok 10 könnyű szelektálhatósága fontos feltétele a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológia további fejlődéséhez. Mivel a transzformáció, és ennek következményeképpen a plazmid dezoxi-ribonukleinsav létrejötte igen ala- 15 csony frekvenciával végbemenő esemény, gyakorlatilag szükséges egy olyan funkcionális vizsgálat, amely lehetővé teszi a sejtek milliói közül annak a sejtnek (sejteknek) a kiválasztását, amely félvette a plazmid dezoxi-ribo- 20 nukleinsavat. Ez fontos, mivel a nem szelektálható dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciák beépülhetnek a vektorokba, és így egy adott antibiotikum rezisztencia gént anaktiválhatnak. így transzformációkor azok a sejtek, amelyek 25 tartalmazzák a vektort, és az adott, számunkra érdekes dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát, a megfelelő antibiotikumon izolálhatunk. A találmány szerinti vektorok különösen előnyösek, mivel igen nagymértékben változékonyak, 30 és ezenkívül transzformálhatok és szelektálhatok higromicin B-re és G418 antibiotikumra érzékeny eukariota és prokariota sejtekben, ha azok képesek osztódni és felvenni a dezoxi-ribonukleinsavat. Ez azért fontos, 35 mivel napjainkban a legtöbb rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikában eukariota polipeptideket állítunk elő, például proinzulint, inzulin A láncot, inzulin B láncot, humán növekedési hormont, marha növekedési hormont, 40 interferont, szomatosztatint, thimozin alfa l et és hasonló vegyületeket, mégpedig prokariota gazdasejtekben. A prokariota sejtek nem képesek cukormolekulákat hozzáépíteni az eukariota eredetű polipeptidekhez. 45 így a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technikákkal transzlációt követően módosult eukariota polipeptideket, mint például a glikolizált polipeptideket, eukariota gazdasejt és megfelelő eukariota rekombináns dezoxi-ri- 50 bonukleinsav klónozó vektorok nélkül nem tudunk előállítani. A találmány szerinti vektorok megfelelnek a fenti igényeknek, és szélesítik a rekombináns dezoxi-ribonukleinsav technológiá- 55 ból adódó lehetőségek körét. így fokozódik a lehetősége mind a nem módosított, mind pedig a transzlációs események után módosult proteinek eukariota sejtekben való előállításának lehetősége. go Az alábbiakban a következő kifejezéseket használjuk: strukturgén: polipeptidet meghatározó dezoxi-ribonukleinsav - -szekvencia szabályozóelem: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely irá-2
