195248. lajstromszámú szabadalom • Eljárás higromicin B és G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát meghatározó rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektorok és ezek eukarióta és prokarióta transzformánsai előállítására
195248 4 nyitja és szabályozza egy strukturgén átírását (transzkripció) és kifejeződését eukariota promoter: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely részben elősegíti és szabályozza egy strukturgén kijeződését egy eukariota sejtben prokariota replikon: olyan dezoxi-ribonukleinsav-szekvencia, amely szabályozza és kontrollálja a dezoxi-ribonukleinsav replikálódását egy prokariota sejtben rekombináns dezoxi-ribonukleinsav klónozó vektor: bármilyen anyag, közte, de nem csupán, plazmidok, bakteriofágok és vírusok, amelyek dezoxi-ribonukleinsav molekulákból állnak, amihez viszont egy vagy több további dezoxi-ribonukleinsav szegmens kapcsolható vagy kapcsolódott transzformáció: dezoxi-ribonukleinsav bejuttatása egy érzékeny gazdasejtbe, ez a molekula megváltoztatja a genotípust, és így stabil és öröklődő változást okoz a felvevő sejtben inszerciós izomer: annak a két vagy több lehetséges rekombináns dezoxi-ribonukleinsav molekulának az egyike, amely akkor keletkezik, ha egy dezoxi-ribonukleinsav fragmenst beépítünk a recipiens dezoxi-ribonukleinsav két vagy több, erre alkalmas helyének egyikébe. A találmány szerinti vektorok előállítására úgy járunk el, hogy egy vagy két, különböző strukturgént és az ehhez kapcsolódó szabályozó szekvenciát tartalmazó dezoxi-ribonukleinsav-molekulát állítunk elő; a gén és a szabályozó szakasz a higromicin B és a G418 antibiotikumok egyikével vagy mindkettővel szembeni rezisztenciát határoz meg. Az eljárás során a pKC203 jelű plazmidot BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a két fenti antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 7,5 kb nagyságú, BglII restrikciós fragmenst, vagy a pKC203 vagy pKC222-jelü plazmidot BglII és Sáli restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a két antibiotikummal szembeni rezisztenciát meghatározó 2,75 kb. nagyságú Sall/Bglll restrikciós fragmenst, vagy a pKC222-jelű plazmidot BglII és SacI restrikciós enzimmel kezeljük, és izolál3 juk a higromicin B antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 1,51 kb SacI/ /BglII restrikciós fragmenst, vagy a pKC222-jelű plazmidot Sáli és EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, és izoláljuk a G418 antibiotikummal szembeni rezisztenciát hordozó 1,65 kb nagyságú EcoRI/Sall restrikciós fragmenst. A fenti módon kapott dezoxi-ribónukleinsav-szekvenciát eukariota promotert és adott esetben prokariota replikont tartalmazó második dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciához ligáljuk (kapcsoljuk). A ligációt követően kapott dezoxi-ribonukleinsav-szekvenciát plazmid előállítására zárjuk, ez egy gazdasejtbe transzformálva, és a transzformált sejtet higromicin B vagy G418 antibiotikum jelenlétében tenyésztve és a túlélő sejteket szelektálva stabilizálható és fenntartható. A találmány szerinti eljárás során, ahogy azt példákkal bemutatjuk, higromicin B és G418 amino-glükozid antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát biztosító bakteriális plazmid dezoxi-ribonukleinsavat használunk fel olyan új plazmidok előállítására, amelyek higromicin B vagy G4I8 antibiotikumokra szenzitív (érzékeny) eukariota és prokariota gazdasejtekben kifejezik a rezisztenciát. így a találmány szerinti eljárás felhasználható gyakorlatilag bármilyen sejt dezoxi-ribonukleinsavval való klónozására. Ezenfelül, a találmány szerinti vektorok azon képessége, hogy mind eukariota, mind pedig prokariota sejtekre toxikus antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát fejeznek ki, lehetővé teszi számunkra, olyan funkcionális vizsgálatok elvégzését, amelyek során szelektáljuk és stabilizáljuk a fenti vektorokat hordozó sejteket. Az alábbi, szemléltető jellegű kísérlet során olyan bakteriális plazmid dezoxi ribonukleinsavat használunk, amely 7,5 kb nagyságú, és a BglII restrikciós enzimmel való kezeléssel kapjuk a pKC203 plazmidból. A pKC203 plazmid körülbelül 15 kb nagyságú, és ismert módon könnyen izolálható az E. coli JR225 sejtekből. Az E. coli JR225 törzs ismert az irodalomból (Davies és O’Connor, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 14, 69, 1978), a törzset megtaláljuk az American Type Culture Collection, Rockville, Maryland törzsgyűjteményében. A törzsgyűjteményből a törzs ATCC 31912 sorszámon megrendelhető. A pKC203 plazmid restrikciós és funkcionális térképét a mellékelt 1. ábrán mutatjuk be. Az l., és a következő ábrák sem mértékarányosak. A pKC203 7,5 kb nagyságú BglII restrikciós fragmense tartalmazza a higromicin B és a G418 antibiotikumokkal szembeni rezisztencia kifejezésére szükséges strukturgéneket és szabályozó elemeket. Ezt a fragmenst a pSV5 gpt plazmidba ligáljuk (ez a plazmid és előállítása ismert, lásd Mulligan és Berg, Science, 209, 1422, 1980). A pSV5 gpt plaz-3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
