195245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés sejthalmazból meghatározott biológiai sejtek kiválasztására, a kiválasztott sejtek legalább egy tulajdonságának megfigyelésére
eszközét nem lehetett ismételt módon olyan helyre irányítani, hogy ugyanannak a sejtnek a többszöri megfigyelése lehetővé váljon. A fluoreszcens emissziót két hullámhosszon, mégpedig 510 nm és 515 nm értékeken mérve a polarizáció egy minimális szintjét Figyelembe véve a kiválasztásra alkalmas kritérium határozható meg. Ennek megfelelően a lymphociták vizsgálandó részcsoportjába tartozó sejteket az első lépésben úgy azonosítjuk, hogy az említett minimális szint elérését az 1 sejthordozón levő minden sejttel kapcsolatban ellenőrizzük, vagyis a kritérium teljesülését vizsgáljuk. Stimulált állapotba való átmenet során az említett részcsoportba tartozó stimulált sejtek polarizációs foka mintegy 0,14 körüli értékre csökken az 510 nm emissziós hullámhosszon. A polarizációs foknak ezt a csökkenését csak az említett részcsoport sejtjeire lehet megfigyelni. A 4. ábrára hivatkozva a továbbiakban olyan elrendezést ismertetünk, amelyben az említett tesztek az 1 sejthordozón elhelyezkedő minden sejt esetében elvégezhető. Az 1 sejthordozón levő sejteket először általában foszfáttal pufferolt foszfátsó (PBS) és fluoreszcein-diacetát (FDA) oldatokkal mossuk át. Ez utóbbi a íluorokromázis jelensége révén behatol a lymphocita sejtekbe és ott fluoreszceinné alakul át. Ezt követően 470 nm hullámhosszú sugárzással a fluoreszceint gerjesztjük, és ezzel a jellegzetes emiszsziós spektrumú sugárzását kiváltjuk. Az 1 sejthordozón levő lymphocita-sejtek közül a kívánt részcsoportba tartozókat ezt követően oly módon választjuk ki, hogy 20 optikai elemzőkészülékkel (4. ábra) az I sejthordozón levő minden sejtet külön-külön egyenként megfigyeljük. A 20 optikai elemzőkészülék (4. ábra) 21 cirkóniumlámpát (vagy megfelelő lézert tartalmaz, amely 470,1 nm és 468 nm hullámhosszúságú csúcsokkal jellemzett fény kibocsátására alkalmas, és így nincs szükség olyan gerjesztő szűrő alkalmazására, amely az 510 nm és 515 nm, tehát a vizsgálat szempontjából érdekes hullámhosszú fény kiküszöbölésére alkalmas lenne. A fény a 4. ábra síkjára merőlegesen síkban polarizált, ezt 22 polarizátor biztosítja, amelyre 21a gyűjtőlencsével összefogott fénynyaláb jut. A rajzon körök jelzik a síkbeli polarizációt. A síkban polarizált fény nyalábja 23 tükörre jut, amely nyalábosztóként működik, mégpedig oly módon, hogy az 500 nm-nél nagyobb hullámhosszúságú fényt átengedi, míg az ez alatti hullámhosszúkat visszatükrözi, ily módon a 21 fényforrásból származó fény az 1 sejthordozóra jut 24 lencsén keresztül. Az egyes sejtek által kibocsátott fluoresz cens fényt az 1 sejthordozó felületén külön-külön mérjük és rögzítjük. A fluoreszcens fény 23 tükrön és 24a lencsén keresztül 25 polarizátorra jut, amely például Glenn-Thompson-féle polarizátor. A 25 polarizátor 13 8 a fluoreszcens fényt két részre bontja, mégpedig a rajz síkjával párhuzamos síkban polarizált nyalábra (ezt a 4. ábrán vonalkák jelzik), amely az eredeti beesési irányban halad tovább, valamint a rajz síkjára merőlegesen polarizált másik nyalábra (ezt mutatják a körök), amit a beesési irányra merőlegesen a 25 polarizátor tükröz és irányban továbbít. A polarizált nyalábokat 26 és 27 nyalábosztók két-két egyenlő intenzitású és egymásra merőleges nyalábra osztják fel. Az így kialakított négy fénynyaláb 28, 29, 28’, 29’ interferenciaszürőkön halad át, amelyek 510 nm-re és 515 rim-re vannak beállítva. A szűrők után a fénynyaláb intenzitását 30, 31 fotosokszorozók mérik, amelyekből egyidejűleg négyet alkalmazunk. A mért négy intenzitásértéket a 16. ábra szerinti számítógépes rendszerben tároljuk,és eközben meghatározzuk mindkét hullámhosszra, tehát az 510 nm és az 515 nm értékre a polarizáció fokát. A polarizáció P fokát, mint ismeretes a P= (I,/— lx)/(l,-,-U) képlet határozza meg, ahol I„ a párhuzamos, lx a merőleges polarizációjú fénynyaláb intenzitása. A P510 és PSI5 kiszámítása után valós időben képezzük a P510/P515 hányadost, amelyet ellenőrző értéknek tekintünk. Miután minden sejtet ellenőriztünk, a vonatkozó ellenőrző értékeket meghatároztuk és tároljuk, a későbbiekben nagyon egyszerű kiválasztani azokat a sejteket, amelyekre az ellenőrző érték egy adott szintet elér, például nem marad meg 1,3, mint határérték alatt. Ezeket a sejteket a továbbvizsgálandó részcsoportba soroljuk. Miután ezt a meghatározást egyszer elvégeztük, a következő méréseket vagy megfigyeléseket, a különböző sti muláló hatásokkal szemben kapott válaszok rögzítését csak azokra a sejtekre vonatkozóan végezzük el, amelyek a kijelölt részcsoportba tartoznak, míg a többi sejtet figyelmen kívül hagyjuk. Így például a részcsoportba tartozó sejteket újból ellenőrizhetjük abból a szempontból, hogy a polarizációs fok változása mekkora, vajon ez elegendő-e ahhoz, hogy ezeket a sejteket aktívaknak tekinthessük, és így alkalmasak lehetnek-e egy-egy antigén azonosítására. A fentiekből nyilvánvaló, hogy az egyes sejtek egyedi elemzése csak akkor végezhető el, ha a 20 optikai elemzőkészülék optikai felbontóképessége egy sejtátmérő nagyságrendjébe esik, amit a mikroszkóp objektívjével kell átfogni. A sejteket tartalmazó hordozót lépésenként toljuk el a mikroszkóp alatt, a perforálásban kialakított egyik 2 nyílástól a másikig. Ennek megfelelően igen pontos működésű mechanikai elhelyező rendszerre van szükség, amilyent például a 16. ábra mutat be. Az optikai elemzőkészülék egy másik kiviteli alakjában az 1 sejthordozó lépésenkénti eltolásának követelményét azzal kerüljük el. 14 195245 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
