194940. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológiai eljárás új tumorellenes hatású piridil-kinolin származék és eljárás az e vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
A találmány tárgya eljárás egy új, a sztreptonigrinnel rokon szerkezetű, tumorelle nes hatású vegyület, valamint eljárás a hatóanyagként e vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított új vegyület a Strepíomyces flocculus tenyészetből nyert, (1) képletű sztreptonigrin antibiotikummal (például Antibiotics Annual, 950—953 (1959—1960)) anaióg szerkezetű. A fenti vegyület jelentős tumorellenes hatással rendelkezik, és az Amerikai Egyesült Államokban és több európai országban széleskörű klinikai kipróbálás alatt áll. A sztreptonigrinnel végzett klinikai kísérletek a fenti tumorellenes hatású vegyület vinkrisztinnel, prednizonnal vagy bleomicinnei való kombinációjának limfoszarkoma, retikulumsejt szarkoma, rosszindulatú melanoma és gyermekek nem-Hodgkin-limfómája kezelésében való felhasználására irányulnak. Azonban — magas toxicitása miatt — a sztreptonigrin, mint terápiás szer nem került kereskedelmi forgalomba. A sztreptonigrinnél kisebb toxicitású, de ugyanolyan erős tumorellenes hatással bíró vegyöletek előállítása céljából számos sztreptonigrin-származékot szintetizáltak, de eddig még nem találtak megfelelő vegyületet. Olyan vegyületek kimutatására, amelyek alacsony toxicitásuk mellett a sztreptonigrin erős tumorellenes hatását megtartják, különféle mikroorganizmus-tenyészeteket vizsgáltunk át. Ennek eredményeként azt tapasztaltuk, hogy egy, a Strepíomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmus az (I) képletű vegyületet termeli, amely vegyület citotoxicitása a sztreptonigrinénél alacsonyabb. A találmány szerinti eljárással előállított vegyület a sztreptonigrinhez igen hasonló. A sztreptonigrintől annyiban különbözik, hogy a kinolingyűrűn 6-os helyzetben metoxicsoport helyett hidroxilcsoportot tartalmaz. Az új vegyületet a leírásban MG883—12F2 vegyületként említjük a továbbiakban. Az MG883—12F2 vegyület valamivel erősebb tumoretlenes hatást mutat, mint a sztreptonigrin, és ugyanakkor — mint már említettük — citotoxikus hatása alacsonyabb, így tumorellenes hatású szerek hatóanyagaként potenciálisan használható. Az MG883—12F2 vegyületet — a kinolingyűrűn 6-os helyzetben lévő szabad hidroxilcsoportját felhasználva — egyéb származékok előállításának köztitermékeként is hasznosíthatjuk. Az MG883—12F2 tumorellenes hatását ismert, tenyésztett sejtek szaporodását gátló képességének mérésével határozzuk meg. Az MG883—12F2 közepes inhibitor-koncentrációja (ID50) tenyésztett egér leukémia sejtek (P388 sejtek) ellen például 0,5 mg/ml. Az MG883—12F2 vegyületet mikrobiológiai eljárással állítjuk elő. A találmány szerinti eljárás értelmében a Streptomyces albus MG883—12F2 mikroorganizmust, vagy 1 2 annak egy mutánsát tápkőzegben tenyésztünk, majd a kívánt vegyületet a tenyészetből kinyerjük. Fenti mikroorganizmust talajból izoláltunk, és a Fermentation Research Institute, Agency of industrial Science and Technology-nál 1984. február 20-án helyeztük letétbe, FF.RM—P 7461 számon, „Szubstance MG-883-12F2“ jelzéssel, amely a Budapesti szerződés alapján a FERM BP—930 megjelölést kapta. A mikroorganizmus tenyésztésére bármely olyan tápközeg alkalmas, amely az MG883— 12F2 vegyületet termelő mikroorganizmus ál tal hasznosítható tápanyagforrásokat tartalmazza. Célszerűen az Actínomycesek tenyésztésére szokásosan használt táptalajokat használjuk. Szénforrásként például glicerint, glükózt, szaccharózt, maltózt, dextrint, keményítőt, zsírokat és olajokat használhattunk. Nitrogénforrásként megfelelnek mind a szerves anyagok, például szójababliszt, gyapotmagolaj-pogácsa, húskivonat, pepton, szárított élesztő, élesztőkivonat és kukoricalekvár; mind a szervetlen vegyületek, például ammóniumsók és nitrátok, így ammónium-szulfát, nátrium-nitrát és ammónium-klorid. Kívánt esetben szervetlen sókat, például nátrium-kloridot, káfium-kloridot, foszfátokat és nehézfémsókat is adhatunk a tápközeghez. A fermentálás során fellépő habzás megakadályozására megfelelő habzásgátló szereket, például szilikont és szójababolajat is adhatunk a tápközeghez, a szokásosan használt mennyiségben. A fermentálást előnyösen az antibiotikunok fermentálására szokásosan használt módszer szerint aerob, folyékony merített tenyészetben végezzük. A tenyésztési hőmérséklet célszerűen 20 és 35°C között lehet, előnyösen 25—30°C. Az MG883—12F2 vegyület mennyisége a levegőztetett, kevert tenyészetben 3—4 nap alatt éri el a maximális értéket. A fenti módon olyan tenyészetet nyerünk, amelyben az MG883—12F2 vegyület felhalmozódott. A fenti anyag többsége a tenyészet felülúszójában található. A tenyészetből az MG883—12F2 vegyületet bármely arra alkalmas módszerrel kinyerhetjük. Egyik módszer szerint extrakciót alkalmazunk, közelebbről, a tenyészet felülúszójában lévő MG883—12F2 vegyületet az MG883— 12F2 vízzel nem elegyedő oldószerével _ például etil-acetáttal, butil-acetátta! vagy kloroformmal — extraháljuk. Az MG883—12F2 tenyészetből való kinyerésére alkalmazható másik módszer adszorpciós folyamaton alapul, amelynek első lépésében az MG883—12F2— t tartalmazó folyékony anyagot — például a tenyészet szűrletét vagy az előző módszerrel kapott extraktumot — megfelelő adszorbensen^ — például szilikagélen vagy Dia-Ion HP20 -on (Mitsubishi Chemical Industries Ltd) oszlopkrornatográfiának vagy folyadékkromatográ-2 194940 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
