194916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a táplálkozást szelektíven gátló újtípusú hatóanyag előállítására
194916 ultraszüréssel kezdjük Amicon „hollow fiber“ készüléken egy 50 000 daltonnal szeparáló oszlopon, célszerűen nyomás, illetve megfelelő szivattyú alkalmazásával. Az így kapott ultraszűrletet ezután vákuum-bepárlással töményítjük, és az oldhatatlan részt preparatív centrifugán elkülönítjük, vagy Zeiss lapon vákuum segítségével kiszűrjük. A kapott csapadékmentes elegyet 0°C és 10oC közötti hőmérsékletre hütjük, és 55 tömeg%-os triklór-ecetsavból annyit adunk hozzá, hogy az elegy triklór-ecetsav koncentrációja 5 tömeg/tf.% és 25 tömeg/tf.% között, előnyösen 9—11 tömeg/tf.% legyen. Az így kezelt oldatot ezután 0°C és 5°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 1 óráig állni hagyjuk, majd a kivált csapadékot, illetve zavarosságot ugyanilyen hőmérsékleten ultracentrifugálással vagy Zeiss szűrőlapon vákuummal történő szűréssel elkülönítjük, amikor is tiszta, éles, sárgás színű oldatot kapunk. Mint az előző szabadalmi leírásokból ismeretes a triklór-ecetsav eltávolítója az ultraszűrés után még jelenlévő fehérjéket, így az albumint is, amíg viszont a hatóanyag, a szatietin oldatban marad. A következő tisztítási lépésként preparatív gélkromatográfiát alkalmazunk 4000 dalion molekulatömeg alatti kizárási térfogatú géloszlopon. Ez történhet Sephades G—15, G—10 vagy G—25 géllel töltött oszlopon. Az elúcióhoz előnyösen 0,1 M ammónium-acetát oldatot használunk, mivel ez illékonysága miatt iiofilizálással viszonylag könnyen eltávolítható. Emellett 0,9 tömeg%-os fiziológiás nátrium-klorid oldat vagy különféle foszfát pufferek is alkalmazhatók az eluáláshoz. Az aktív frakciók a géloszlop kizárási térfogatánál jelennek meg (kizáródnak a gélből az oszloptérfogat kb. egyharmadát jelentő eluens térfogatnál), amelyeket egyesítünk és Iiofilizálással töményítünk. A következő tisztítási lépésnél is gélkromatográfiát használunk 3000 dalton molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen, célszerűen Bio—Gel P—2 oszlopon desztillált vizes közegben. Ez a tisztítási lépés azt eredményezi, hogy eltávolítjuk a jelenlévő sókat és az esetleges jelenlévő egyéb kismolekulasúiyú szennyezéseket. A kizárási térfogatnál megjelenő szatietin aktivitású frakciókat egyesítés után liofilizáljuk, a nyers termék halványsárgás, vagy fehér por, melynek izoelektromos pontja pl: 7,0—7,1 Ezúton 1 liter emberi szérumból vagy plazmából kiindulva 8—10 mg liofilizált nyersterméket kapunk, amely már alkalmas étvágyszabályozó-szerként való felhasználásra, mivel szatietin aktivitása 25 Sz.E./mg körül van. A termék szatietin-aktivitását az általunk kidolgozott biológiai értékmérési módszerrel mérjük; 1 szatietin-egységen (Sz.E.) azt a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely 96 óra hosszat éheztetett 200—240 g súlyú CFY nőstény patkányoknak intracerebroventrikulá-3 risan beadva a standard tápdugó fogyasztását a táplálékadás első napján az átlagos 24,04 ± 0,76 g-ról 10 g-ra csökkenti. Az így nyert szatietin aktivitású nyersanyag kémiailag még nem tekinthető egységes homogén terméknek, mivel elektroforetikus módszerekkel vizsgálva, pl. poliakrilemid gélelektroforézis nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében vagy izoelektromos fókuszálás ítb., még több fehérjefestésre pozitív sávot mutat. Az egységes hatóanyag előállítására irányuló törekvéseink során a korábbiaktól < ltérő hatékonyabb és egyszerűbb módszert dolgoztunk ki. A találmány szerinti eljárás a lépéseként proteolitikus emésztést alkalmazunk, abból a meggondolásból, hogy az emész- és során a szennyező komponensként még előforduló peptidek és fehérjék lebomlanak, viszont a szatietin, mint glikoprotein sokkal stabilabb a fehérjeemésztési eljárásokkal szemben. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezése során tehát az előzetesen ismertetett tisztítási módszerekkel nyert nagytisztaságú terméket kissé lúgos kémhatású 8,1—8,2 pH-tartományú pufferben, előnyösen 0,1 M trisz-hidroklorídban rázogatás vagy keverés közben feloldjuk, és az oldathoz a liof ilizált termék össztömegére számított 0,01—0,2 előnyösen egytized tömegű tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk. Ezután az elegyet 36—39, előnyösen 37— 38°C-on 20 — 30 előnyösen 24 órán át tartjuk. A reakcióelegyet előnyösen rázzuk, illetve keelteltével újabb mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk az elegyhez, de most már az eredeti enzimennyiség felét, és folytatjuk az emésztést. Körülbelül 24 óra elteltével az elegyet 0°C és 10°C közé hűtjük, és annyi triklór-ecetsavat adunk hozzá, hogy az elegy triklór-ecetsav koncentrációja 4—6, előnyösen 5 íömeg/tf.% körül legyen. Az elegyet ezután —15°C és -j- 5°C között legalább 1 óra hosszat és legfeljebb 24 órán át állni hagyjuk. Ezután a kivált oldhatatlan részt, előnyösen ultracentrifugálással vagy Zeiss lapon történő szűréssel eltávolítjuk. A tisztítás következő lépésében a jelenlévő triklórecetsavtól, sóktól, az alkalmazott puffertől és egyéb kismolekulatömegű íragmensektől szabadulunk meg miután az emésztéshez használt enzimfelesleget a triklórecetsavas kezelés eltávolította. Ezt a találmány értelmében úgy végezzük, hogy a tiszta, éles reakcióelegyet egy 3000—4000 dalton molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen, előnyösen vizes közeggel eluálunk. A tiszta, homogén szatietin-D kizáródik a gélből, és a géloszlop térfogatú gélen, előnyösen vizes közeggel eluálunk. A tiszta homogén szatietin-D kizáródik a gélből, és a géloszlop térfokat egyharmadának megfelelő térfogatnál jelenik meg az elúció során (2. ábrá) Az ionmentes vízzel eluált, hatóanyag-tartalmú frakciókat egyesítjük és liofi-4 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 5b 60 65
