194916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a táplálkozást szelektíven gátló újtípusú hatóanyag előállítására
194916 lizáljuk. Hófehér jólkezelhető port kapunk, amely már teljesen egységes. Ezt a hatóanyagot szatietin-D-nek neveztük el, miután fizikai és kémiai sajátságai révén különbözik a korábban már előállított homogén szatietin termékünktől. A találmány szerinti eljárással izolált egységes és tiszta szatietin-D hatóanyag molekulatömegét SDS/nátrium-dodecil-szulfát/-gél-elektroforézissel határoztuk meg. E szerint az anyag molekulatömege a 40 000— 50 000 dalton tartományba esik. Ugyancsak az SDS-gél-elektroforetikus vizsgálat bizonyította a termék egységes voltát, mivel egyetlen sávot mutatott fehérjefestésre és szénhidrátfestésre is. Ez ugyancsak a termék glikoprotein természetére utal. Az anyag izoelektromos fokuszálása 3-10, illetve 3-5 pH értékű amfolin jelentésben történő futtatással azt eredményezte, hogy izoelektromos pontja pl: 2,9—3,1 körüli értéknél van. Ez az eddigiektől eltérő, és így egyúttal új termékként kezelhető anyag jelenlétére utal vérszérumban. A termék elemi analízise az alábbi összetételt adta: Fehérjetartalom: 20—23% Szénhidráttartalom: 56—60% Kémiailag nem kötött víztartalom: 6—10%. A fehérjetartalmat mikrobiuret módszerrel és hidrolízis után aminosav analízissel határoztuk meg. Az aminosav analízis eredménye a következő: Asp 2,83%, Thr 1,61 % Ser 1,25%, Glu 3,60%, Pro 1,36%, Gly 0,87%, Alá 1,18%, Cys 0,16 %, Val 0,93 %, Met 0,17% Ile 0,76%, Leu 1,25%, Tyr 1,42%, Phe 0,77%, Lys 3,67%, His 0,22%, Arg 0,67%; tehát az összes aminosav: 22,71%; a glükózamin 4,90%. A szénhidráttartalom megoszlása például egy mintában a következő: ramnóz: 4,5%, mannóz 8,05%, galaktóz 30,3%, glükóz 14,4%; összesen 56,5%. A fenti elemzési és jellemzési adatokból jól, illetőleg egyértelműen kiderül, hogy az emésztéses eljárással előállított termékünk új, eddig nem ismert glikoprotein, amelyet vérszérumból különítünk el, és hozzávetőlegesen 1 liter vérszérumból 4—6 mg egységes terméket nyerünk, amelynek szatietin aktivitása 50—100 Sz.E./mg körül van. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példák szemléltetik. 1. példa a.) 3000 ml humán szérumot Amicon UM—10 membránon állandó keverés közben, 3—4 atm. nyomás alkalmazásával átszűrünk. A kapott, mintegy 2000 ml ultraszűrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9000 g-vel 30 percig centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés és hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55 tö-5 4 mcg%-os triklór-ecetsavat, és az elegyet 5— 10’C hőmérsékleten 1 óra hosszai állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5°C körüli hőmérsékleten 30 000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikailag teljesei tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatografáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-puffer-o dattal (pH=6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk és egy 2,5=90 cm méretű Bio-Gel P—2 gél-oszlopra visszük. Az oszlopot desztillál vízzel eluáljuk, és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 25 mg nyers, sómentes szatietint kapunk sárgásfehér por alakjában. b.) 100 g fenti módon kapott nyerste mékből 0,1 M trisz-hidroklorid, pH: 8 ,2 értékű pufferoldattal 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk szobahőmérsékleten rázogatással vagy keveréssel. Az így kapott kissé vagy gyengén opálos oldathoz 10 mg tripszint és egyidejűleg 10 mg kimotripszint adunk, majd az elegyet jól felkeverjük. Ezután a még ki ssé csapadékos elegyet 37°C-os fürdőbe helyezzük és időként felrázzuk, illefve felkeverjük. 5 óra elteltével újabb mennyiségű erzimet, nevezetesen 5 mg tripszint és 5 mg kimotripszint adunk az elegyhez, és folytatjuk a 37°C-on történő inkubálást további 19 órán át, azaz összesen 24 óráig inkubáljuk a reakcióelegyet. Az emésztés befejezése után az elegyet 0°C és -F5°C közé hűtjük, és hozzáadunk 0,1 tf./tf.%, azaz 2 ml 55 tömeg/tf.% hideg, -F5°C körüli triklór-ecetsavat, majd az elegyet összerázzuk,és lefagyasztva egy éjjelen át, de legalább 1 óráig 0°C és 5°C között állri hagyjuk. Ezután a kissé zavaros esetenként csapadékos elegyet 15—2 000 g-vel 25 percig a fent említett hőmérsékleten ultrrcentrifugáljuk. A tiszta felülúszót ezután szobahőmérsékleten egy 5,0x45 cm méretű NBio-Gel P—2 géloszlopra visszük, és az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk. A 250 és 320 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizaljuk. Ily módon 58 mg hófehér, sómentes szatietint kapunk, melynek biológiai aktivitása 50—100 Sz.E./mg. 2. példa a.) 3000 ml humán szérumot Amicon „hollow fiber“ 30000-es oszlopon állandó keverés közben, 3—4 atm. nyomás alkalmazásáv îl átszűrünk. A kapott,mintegy 2000 ml ultrasmrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9)00 g-vel 30 percig centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés é ; hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55%-os triklórecetsavat, és az elegyet 5— 1 )°C hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5°C körüli hőmérsékleten 3) 000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikai-6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
