194916. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a táplálkozást szelektíven gátló újtípusú hatóanyag előállítására
194916 1 A találmány tárgya eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható új hatóanyag elkülönítésére vérszérumból. A 178 703 lajstromszámú magyar bejelentésünkben ismertettünk egy eljárást, amelynek segítségével egy eddig nem ismert új hatásmódú szelektív anorexiás, azaz a táplálékfelvételt gátló anyagot állítottunk elő emberi plazmából. Ez az anyag a szatietin nevet kapta, amely egy részlegesen tisztított termék volt, amely azonban hatékonysága révén már messze felülmúlta az eddig ismert hasonló hatású anyagokét. A termék tisztítása a plazma ultraszűrése és két lépéses gélkromatográfia Sephadex G—15 és Bio—Gel P—2 géleken történt. Sikerült az anyag peptid természetét és a nagyobb mennyiségben előforduló aminosav mennyiségi viszonyokat is igazolni. Az aminosavak mellett a termék hidrolízise után cukorkomponenseket is találtunk, így már akkori feltételezésünk szerint a specifikusan a táplálkozási központra ható terméket egy glikoproteinnek tartottuk. A találmány továbbfejlesztéseként azt találtuk, hogy további eljárás segítségével a hatékony frakció tovább bontható, azaz tisztítható, és a 183 590 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint háromszor-négyszer hatékonyabb termék állítható elő, amely kémiai összetétel szempontjából lényegesen eltér a korábbiakban említett eljárással kapott hatékony terméktől, és ez már kémiailag tiszta, egységes, homogén hatóanyagnak tekinthető, amelynek fizikai jellemzőit és elemi összetételét is meghatároztuk. A fentiekben említett találmány értelmében az emberi plazmát az ultraszűrés után egy lényeges lépésnek vetettük alá, nevezetesen a plazmaszűrletet triklór-ecetsavval kezeltük azon célból, hogy a még jelenlévő szérumfehérjéket (albumin stb.), amelyek bizonyos mennyiségben képesek átjutni az Amicon membránon, eltávolítsuk. A triklór-ecetsavas kezelés után a kicsapódott szérumfehérjéket centrifugálással ülepítettük, és a tiszta felülúszót, amely a biológiailag aktív szatietin frakciókat tartalmazta, géloszlopokon tovább tisztítottuk. Első lépésben Sephadex G—15 oszlopon ámmónium-acetát puffert használva az elúcióhoz, a kizárási térfogatnál összegyűjtöttük azokat a frakciókat, amelyek aktivitást mutattak és megfelelő töményítés után Bio-Gel P—2 oszlopon sótalanítottuk. A sómentes aktív frakciók már nagytisztaságú anyagként voltak kezelhetők, ez az anyag a biológiai kísérletekhez — beleértve az összes táplálékfelvételt jelentő kísérleteket — teljes mértékben alkalmas volt. Ebben a fázisban már csak a szatietin aktivitást nem befolyásoló, kisebb molekulájú peptidek és glikopeptidek voltak jelen, amelyeket ezután elektroforézissel és affinitási kromatográfia segítségével távolítottunk el. Az affinitási kromatográfiával Con—A Sepharose 2 2 oszlopon történő frakcionálás és ismételt Bio— Gel P—2 oszlopon történő sótalanítás után a tiszta hatóanyagot liofilizálás útján nyertük. Az így előállított anyag glikoproteinnr k bizonyult, amelynek peptidtartalma alacsony (5—25%) és szénhidráttartalma magas (60—90%) volt. A hatóanyag molekulasúlya az 50 000—70 000 dalion tartományba esett és izoelektromos pontját neutrálisnak, nevezetesen pl: 7,0—7,1-nak találtuk. Űjabb vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással a korábbi két eljárással kapott terméktől fizikai tulajdonságaiban eltérő, új terméket kapunk, amely kémiailag egységes és ugyancsak szelektíven gátolja a táplálék felvételét. Ezt az anyagot szatietin-D-nek nevezt ik el. A szatietin-D kinyerés legfontosabb műveleti lépéseit az 1. ábra alapján mut ltjuk be. Emberi és/vagy emlős állatokból származó vérszérumot vagy plazmát 50 000 dalton molekulasúly tartományig átengedő szűrőn megszűrjük. Ezt az ultraszürést oszlopon (ún. Hollow fiber technika) végezzük. Ezután a szürletet pároljuk, és a koncerrtrátumból az oldhatatlan részt, célszerűen centrifugáíással vagy szűréssel eltávolítjuk, rtiajd a Folyadékhoz 0°C és 10°C közötti hőmérsékleten 5—25 tömeg/tf.%, előnyösen 9—11 töneg/tf.% koncentrációig triklórecetsavat rdunk, a kicsapódott fehérjéket, célszerűen :entrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk, és a kapott tiszta oldatot 4 000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, 5,0—7,0 pH tartományú pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat koncentráljuk — célszerűen liofilizálással, illetve vákuumbepárlással —, majd 3 000—4 000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, desztillált vízzel eluáljuk (sómentesítjük), és a kapott nyersterméket liofilizált formában tisztítjuk, illetve kezeljük a továbbiakban. A találmány szerinti eljárás értelmében ezt a liofilizált nyersterméket 8,1—8,2 pH-tartományú pufferben, célszerűen 0,1 m trisz-hidrokloridban (2-amino-2-hidroxi-metil-l,3- -propándiol-hidrogén-klorid) oldjuk, és az össztömeg 0,01—0,2, előnyösen egy tized tömegének megfelelő tripszint és ugyanolyan mennyiségű kimotripszint adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután emésztésnek vetjük alá 36—39°C hőmérsékleten 20—30, célszerűen 24 órán át, előnyösen időszakos keverés vagy folyamatos rázás mellett. Az első 2—10 óra elmúltával az elegyhez még fele mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk, és folytatjuk az emésztést. A reakcióelegyből ezután hideg triklór-ecetsavas kezeléssel és 3000—4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen történő kromatografálással a hatóanyagot sómentes formában elkülönítjük (2. ábra). A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezése során a tisztítási műveletet 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
