194914. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vankomicin-só előállítására
194914 rélő gyanta. A vankomicin adszorbeálódik ezen. A gyantáról a vankomicint úgy eluáljuk, hogy vízzel mossuk, és 9,0 és 11,0 közötti pH-jú vizes, alkalikus oldattal eluálunk. Az eluálásra előnyösen például vizes nátrium-hidroxid-oldatot használunk, amelynek pH-ja 10,0—11,0. A vankomicint tartalmazó alkalikus oldatot semlegesítjük, és az antibiotikumot nem funkcionális gyantán újra adszorbeáljuk. Gyantaként például Diaion HP-20 gyantát vagy hasonlót használunk. A telített gyantaoszlopot megfelelő oldószerrel mossuk, előnyösen vizes alkohol-oldattal, például 3—30% etanolt vagy izopropanolt tartalmazó vizes eleggyel. Adott esetben a vizes-alkoholos oldat pH-ját savanyúra állítjuk be, például foszforsavval, ekkor a nem funkcionális gyantáról való eluálás közben a vankomicin difoszfát-sóját kapjuk meg. A vankomicint tartalmazó eluátumot általában töményítjük az oldószer egy részének eltávolításával, például csökkentett nyomáson végzett desztillálással. Az oldatot előnyösen addig töményítjük, míg az ml-enként 250—285 mg vankomicint tartalmaz. A tömény eluátumot foszfát-ionokat képző anyaggal 2,0 vagy alacsonyabb pH-jú-ra savanyítjuk, például vizes foszforsav adagolásával. Adott esetben további foszfát-anionokat adagolunk az oldathoz, például íémsó-dihidrogén-foszíátot, például nátrium- vagy kálium-dihidrogén-íoszfátot. Az így adagolt foszfát-forrás mennyisége széles határok között változhat, általában azonban az oldatban jelenlevő vankomicin tömegére számítva 10— 20%-nyi mennyiséget adagolunk. A vizes, savas oldat 0—20°C-ra való hűtésekor a vankomicin-difoszfát kristályok kiválnak és szűréssel eltávolíthatók. Adott esetben tovább tisztítjuk a terméket ismert módon, például a kristályok hideg vizes mosásával, vagy oldószeres, például alkoholos kezeléssel, de újra kristályosíthatjuk a terméket ismert oldószerekből, például vízből, etanolból vagy másokból. A továbbiakban példákkal illusztráljuk a találmány szerinti új, kristályos vankomiein-difoszfát-só előállítását. 1. példa 15 ml vízben 10 g vankomicint szuszpendálunk, és keverés közben 2 ml 85 tömeg%-os, vizes foszforsavat adagolunk a szuszpenzióhoz. Oldatot kapunk. Az oldatot 16 órán át 0°C hőmérsékleten tartjuk. A kivált kristályos anyagot szűréssel elkülönítjük, 20 ml izopropanollal és ezután 20 ml dietil-éterrel mossuk, végül levegőn szárítjuk. így 7,5 g vankomicin-diíoszfátot kapunk. A termék 194°C hőmérsékleten bomlás közben olvad. 3 A kristályos termék egy részét 120°C hőmérsékleten szárítjuk (a tömegveszteség .11,55% volt, ez 10 mól kristályvíz jelenlétére utal), a mintából elemanalízist végzünk. Elemanalízis a C66H75Cl2N9024-2 H3P04 képlet alapján: számított: C: 48,18, H: 4,96, N: 7,66, Cl: 4,31, O: 31,12, P: 3,77%; talált: C: 47,98, H: 5,19, N: 7,41,'Cl: 4,20, O: 31,04, P: 3,77%. 2. példa Vankomicint tartalmazó vizes fermentlé pH-ját (előállítását lásd 3 067 099 sz. egyesült államokbeli szabadalmi leírás) 6 normál nátrium-hidroxid-oldattal 9-re állítjuk be. A vizes, lúgos elegyet szűrjük, és a szűrlet pH-ját 7-re állítjuk be, majd ismét szűrjük. A szűrletet Ionac X236 gyantából készült nátrium-alakú gyantaoszlopon vezetjük át, az oszlopot vízzel mossuk, és 10 pH-jú borát-pufferral eluáljuk. A neutralizált eluátumban levő antibiotikumot HP-20 gyantából készült oszlopon adszorbeáljuk. A telített gyantát vízzel mossuk, és ezután 0,1 normál foszfcrsav-oldattal és 10% izopropil-alkoholt tartalmazó vízzel eluáljuk. A vankomicint tartalmazó frakciókat egyesítjük (2300 ml), és csökkentett nyomáson 65 ml térfogatúra töményítjük. Az oldat a biológiai értékmérés szerint 258 mg/ml vankomicint tartalmaz. 6 normál foszforsav-oldat adagolásával 2-re állítjuk be az oldat pH-ját. 25°C hőmérsékleten keverjük a savas oldatot, a keverés közben 2,5 g kálium-dihidrogén-foszíátot adagolunk részletekben. Ezután 18 órán át 5°C hőmérsékleten tartjuk az oldatot. A kivált kristályos anyagot szűréssel összegyűjtjük, és 26 ml 5°C hőmérsékletű, 2%-os kálium-dihidrogén-foszfát-oldattal mossuk, a mosást 13 ml 5°C hőmérsékletű ionmentes vízzel, végül 26 ml 5°C hőmérsékletű izopropil-alkoho Hal megismételjük. A kapott kristályos anyagot csökkentett nyomású térben 42°C hőmérsékleten 12 órán át szárítjuk, ami után 13,5 g vankomicin-difoszfáthoz jutunk (kitermelés: 76,6%). 3. példa A találmány szerinti eljárással előállított vankomicin-difoszfát kristályokból álló termék hidratálva hosszú időn át stabil, kristályos, szilárd halmazállapotú anyag. A vankomicin-difoszfát minták stabilitásának meghatározására három terméket állítunk elő a 2. példában megadottak szerint eljárva. A három különböző kísérletből származó mintát 21—28°C hőmérsékleten tároljúk polietilénből készült tartályokban. A három termék fizikai paramétereit a kísérlet kezdetén, a 6., a 12. és a 18. hónapban megvizsgáljuk. A következő táblázatban a vizsgálatok eredményeit adjuk meg. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
