194911. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-alanil-D-izoglutaminil-amantil, valamint ilyen vvegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
194911 etol-amint és 5 ml piridint adagolunk, és a kapott reakciókeveréket egy éjszakán át keverjük. Ezután a dimetil-formamidot elpárologtatjuk, a maradékot 100 ml etil-acetátban oldjuk és 0,1 n sósavval, majd 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal extraháljuk, és az extraktumokat bepároljuk. A maradékot metanolban oldjuk, és a kívánt anyagot vízzel kicsapjuk. Kitermelés 1,28 g (56%), amelynek szerkezetét elemanalízis és aminosavanalízis igazolta. L-alanil-D-izoglutaminil-adamantil-amid Az előző pont szerint előállított termékből metilén-kloridos oldatban 40%-os trifluor-ecetsav oldattal való kezeléssel a terc-butil-oxi-karbonil-csoportot lehasítjuk. Az oldatot 60 perces szobahőmérsékleten való állás után bepároljuk, és a visszamaradó anyagot éterrel elkeverjük. Ily módon 0,9 g terméket nyerünk (trifluor-acetát formájában), amelyet rögtön 5 ml metanolban’oldunk, OH-csoportot tartalmazó anioncserélőgyantával töltött oszlopra adagoljuk és mefanollal eluáljuk. Az eluátumok' bepárlása után 0,8 g (83%) habszerű anyagot nyerünk. Az aminosavanalízis alapján az összetétel: Alá 1,01, Glu 0,97. A termék tisztaságát nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) és papírkromatográfiával 2,5 és 5,7 pH-jú pufferban vizsgáltuk. Az L-alanil-D-izoglutaminil-adamantil-amidot a következőképpen analizáltuk: stacioner fázisként lipofil csoportot tartalmazó szilikagélt (15x0,3 cm-es kolonna) és mozgó fázisként 60-80 térf % metanol és 20-40 3 térf%, 0,2 t%-os vizes trifluor-ecetsav elegyét alkalmaztunk. A detektálást 210 nm-nél UV detektorral végeztük. A mozgófázis mennyisége 20-30 ml/óra volt. Az elválasztáshoz 5 ugyanezen mozgó és állófázist alkalmaztuk, a kolonna mérete: 30 x 2,5 cm volt. A termék tisztaságát ezután még szilikagél-rétegkromatográfiával is vizsgáltuk, n-butanol-ecetsav-víz (4:1:1) és kloroform-me- 10 tanol-ecetsav-víz (40:20:10:5) rendszerben. 0. 5 g nyerstermékből HPLC-vel végzett tisztítás után 0,3 g tiszta terméket nyerünk (95%-os tisztaság), és ezt alkalmaztuk a biológiai vizsgálatokhoz. 15 Farmakológiai vizsgálatok 1. vizsgálat Az immunoadjuváns hatást tengerimala- 20 cokon vizsgáltuk, amelyek hátsó bal mancsába nem komplett Freud-adjuvánsban (FIA) 0,2 ml, 2,5 mg ovalbuminból és 100 p.g L-alanil-D-izoglutamin il-adamantil-amidből (ADP) álló keveréket aplikáltunk. A kont- 25 ro 1-csoportnak csak FIA-ovalbumin keveréket adagoltunk, összehasonlító anyagként az eddig legerősebb adjuváns hatásúnak ismert Mycobacterium tubercolosis baktériumból nyert adjuvánst alkalmaztuk, és ezt FIA-sal 30 és ovalbuminnal együtt egy másik kontroll-csoportnak adagoltuk. A találmány szerinti eljárással előállított új vegyületek hatásá* N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminnal is összehasonlítottuk. Három héttel az 35 ap ikáció után vizsgáltuk a kísérleti állatoknál a 10 és 20 fig ovalbumin adagolására mutatott bőrreakciót. A kapott eredményeket az 1. táblázatban foglaltuk össze. 4 1. Táblázat Ovalbuminnal szembeni késleltetett túlérzékenység tengerimalacoknál szintetikus ADP hatására Vizsgált Dózis Bőrreakció 24 óra után (mm) 10 jig ovalbumin 20 jug ovalbumin FIA FCA MDP ADP 1 mg 100 pg 100 jug 1,0 ± 0,48+/ 3,71 + 0,23/, 2,99 ± 0,23, 2,70 ± 0,21 ' 3,39 5,73 6,07 5,82 ± 0,22 ± 0,33 ^ ± °.2i+; ± 0,27 ' Az adatok 16 kísérleti állatnál 2 mérés átlagát jelentik. +/ jellemző eltérés (p >0,05). Jelölések: FIA = nem komplett Freund-adjuváns (bayol + arlacal 4:1) FCA = komplett Freund-adjuváns (bayol + arlacel + 1 mg Mycobacterium tuberculosis) MDP = N-acetil-rauramil-L-alanil-D-izoglutamin ADF = L-alanil-D-izoglutaminil-adamantil-amid 3
