194868. lajstromszámú szabadalom • Eljárás gyógyászatilag aktív 1,4-dihidro-piridin származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
194H6H J A kalcium antagonist# hálást annal' a halásnak a vizsgálatával demonstráltuk, amelyet a kalciumkoncentráció in vitro növelése váltott ki izolált patkány májkapu erén Épben a tesztben a reakció 50%-os csökkentéséhez 2x10'7 mól koncentrációjú 1 ,4- dihidio -2-(ami~ dazok1-il-metil)-6-metil-4-(3-nilrofenil)-piri-din-3,5-dikarbonsav-3-etil-5~metil- észter volt szükséges Az (I) általános kópletü vegyéleteket a tromboclta aggregáció gátlásának képességere is teszteltük Fantl, Australian J Exp. Bioi Med. Sei.45, 355-62 1967-ben megjeleni munkája nak módosításával. Mivel a trombocita aggregáció a liombusképzödós kezdeti lépése, azért úgy tartják, hogy az olyan vegyületek, amelyek megelőzik, illetve csökkentik a trombocita lapadokópességél. gátolhatják az arteroszklerotikus folyamat elkezdődésót. A gyógyszerek hatásai a tapadó képességre kis mennyiségű araehidonsavat tartalmazó trombocilában dús plazmán mérik, amely jelentősen növeli az aggrégáciÓt in vitro, de fiziológiai szert lehet in vivo is alkalmazni A teszt-eljárást az alábbiakban részletezzük. 2,5-3 kg-os New-Zealand fehér nyulakat Injekcióval a szélső füli vénán keresztül érzéstelenítettük 30-40 mg/kg nátrium penlobarbitonnal A nyaki vörőérbe kandit vezettünk és 100-150 ml vért szívtunk 50 ml-es fecskendőkbe, amelyek 3,8% nátrium-citrálol tartalmaztak (a vér és a citrát aránya 9:1) A vért 200 g mellett (1500 percenkénti fordulatszám) 10 perbig 5 aC-on centrifugáltuk és ' a trombocilában dús plazmát (PRP) eltávolítottuk A trombocitákat ezután szobahőmérsékleten tartottuk egy csavaros tetejű műanyagcentrifuga-csőben, a kísérlet tartama alatt Egy kettős csatornájú trombocita aggregometert használtuk {HU aggregométer, A Browne Ltd, Leicester, Egyesült Királyság), 5 10 percig előmelegített 1 ml es PRP alikvotokat használtunk amelyeket 1100 percenkénti fordulatszám mellett folyamatosan kevertünk Az aggregáció! a PRP mintákhoz adagolt 250 p.mol (8 pl) arachi donsav hozzáadásával indukáltuk ( Az aggregométer teljesítményéi maximálisra állítottuk és a papírkijelző érzékenységét úgy állítottuk be; hogy az arachidonsav reakcióra teljes skálájú kitérést tegyen lehetővé. A kontroll reakciók a 250 nmól arachidon sav adagolása után kapott maximalis eltérést mutatták Az PRP mintákat 1 percig előre inkubaltunk a teszlvegyuletekkel az arachidonsav adagolása után A maximális eltérést az arachidonsav adagolása után ekkor regisztráltuk. Vala mennyi gyógyszert köztiéiben 10-4 mól végső koncentrációnál szkrineltúk, azaz a gyógyszer 10 (d IxlÖ"2 mól koncentrációjú törzsoldatát desztillált vízben feloldva adagoltuk a PRP hez Pozitív kontrollként dazoxibent egy trorrw boxán szlnteláz inhibitort használtunk (Randall! M.J és társai Research 23 145 162. 1981) és valamennyi tesztkomponenst összevetettük a .1 10 15 20 25 30 35 40 15 50 55 60 65 dazoxibennel A leszlveyyülot hatásai a ia/o xiban a teszt vegyülő! iCse aranyában In jezlük ki ahol az iC.so az a dózis amely 60% ban gátolja az arachidorsavval indukált agy regációt Minél nagyobb ez az arany, annal ha lásosabb a vegyület a dazoxibenhez képest Vegyúlel Trombocita aggregáció gátlás hatás arány (dazoxiben -1) 1,1 dihidro 2-\2 (imidazob 1 -il)-etílj-6-metil-4-{2— -nitrofenil)-piridin-3,5-kar~ bonsay-dietilószter 0 79 1.4- dihidro-2~(imidazol-1--ilmetil)-6-metib4~(3-nitro~ fenil)-piridin-3,5-dikarbonsav-3-etll 5-metil~diószter 1 2 1.4- dihidro-2-{2-(imidazol-1-il)— - etilj-6-metil^-4-(2-nitrofenil)— -piridin~3,5-karbonsav—-dimetil-ószter 1.64 1 4-dihidro 2-melil-4-{3- -nitrotenil)~6-[(3-pirldiloxi)~ -netilj-piridin-3,5-dikarbonsav— -5-etil-3-meHI-diészter 1 1 A tromboxán szintetaz gátló hatasu vegyületeket használhatjuk olyan betegségek kezelésére és megelőzésére, amelyek a tromboXanszlnteláz gátlásra reagálnak. Ilyenek például a kardioraszkuláris rendelldhességek( például trombózis, aíeroszklerózis, agy lsemiás rohamok, angina pectoris és perifériás érbeteyse - gek, valamint migrén. Az (I) általános képletü vegyületek et a trómboxántermelóst gátló hatásukra is teszteltük az alábbi standard teszttel a) tromboxán generálás Kb 75 ml véri vettünk érzéstelenített nyulaktól és 200 g nál 10 percig centiitugaltuk, hogy trombocilában dús plazmát kapjunk (PRP) A PRP egy alikvolját 10 percig 37 "C on rnKubáltuk gyógyszer vagy oldószer jelenlétében, A trombocita aggregaciól adonozin difoszfal ada - golásával és adrenalin adagolásával indukátiuk A kémcsöveket 3 percig inkubaltuk 10 000 y nál centrifugáltuk 3-porcig és a feiuluszó 50 ml es alikvotját tromboxán Bz (TxBz) radio immunovizsgálatnak vettük atá b) TxBi rádió irnmunovfssgáldta A teljes inkubációs térfogat 150 jul. amely tartalmaz 50 m.1 3tl 1 (0,005 jiC-ij, 50 ini mintái vagy 5 300 pej autentikus TxB? t kémcsövenként standardként és 50 p.l nyúl nntiszérumol a Ixßz hoz folyan koncentrációban amely a H TxB/ tSO». bari köti meg 1 órás rnkubálás után szobahőmérsékleten a kémcsöveket 16'20 éra hosszat még inkubaltuk 4 *C- on. Ezután 1 ml dexlrán bevonatú aktív sze nel adtunk a kémcsövekhez, melyeket 10'percig jégen tovább inkubaltunk. A minták rnkubalása után 10 000 g-uái 10 percig tarló centi ifugálás következett és 500 ml feluluszót adtunk 5 ml szcinlillácios koklúllioz. A feluUisZgtbap 3
