194497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganattal és vírussal szembeni immunválasz kiváltására alkalmas kompozíció előállítására
zált BALB/c egerekből nyert splenociták további fúziójából P3x63Ag8 egér mielómasejtek 653. variánsával [Keamey és munkatársai: J. Immunoi. 123, 1548-1550 (1979)], amint ezt Wiktor és munkatársai leírták [Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75, 3938-3942 (1978)1 Az anti-G-t kiválasztó hibridómasejteket kiválasztottuk, korlátozott hígítással klónozzuk, és ascites folyadékot állítottunk elő, amint ezt Wiktor és munkatársai szintén leírták (1978, fentebb idézett munka). Az 1104-2 mAb-t választottuk ki, mivel ez kiváló kötődést mutat az ERA vírushoz, de gyenge közömbösítést. Az mAB 515-3 (IgG2a) és 389-1 (IgGl) veszettség elleni vírus nukleokapszidokat hasonló technikákkal izoláltuk a Kelev-vírussal immunizált BALB-/c egerekből. Az alkalmazott veszettségvírus ERA vagy CVS törzseinek állományait szaporítottuk BHK-21 sejtekben standard módszerekkel, lásd. Wiktor és munkatársai: Laboratory Techniques in Rabies (Laboratóriumi technikák veszettséghez), 101-123 oldal (szerkesztők: M. Kaplan és H. Koprowski, 3. kiadás, 1973). ERA RV194-2 és RV509-6 veszettség-antigén variánsokat írtak le, amelyek olyan vírusokat képviselnek, amelyek rezisztensek az anti-G mAb 194-2-vel, illetve 509-6-al történő közömbösítésre [lásd. Dietschold és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80, 70-74 (1983)]. Veszettség oldódó glükoproteinjét (Gs) tisztítottuk virion-kimerített tenyészetfolyadékokból immunadszorbens kromatográfiával, amint ezt Dietschold és munkatársai leírták [Virology, 124, 330-337 (1983)1 Minden anti-G mAb-t ascites folyadékokból tisztítottunk. Az IgG2a izotípus antitestjeit mintegy 1:30 arányban hígítottuk Britton-Robinson pufferral (BRB) pH 8,0-nál [lásd. Gerhard és munkatársai: a „Monoclonal Antibodies” (Monoklonális antitestek) című kiadványban, 317-333 oldal (szerkesztők: R. Kennett, T. McKeam és K. Bechtol, 1980)1 A BRB-ben levő mAb-t átengedjük egy 0,45 p-os Nalgen-szürőn, majd egy Protein A-Sepharose 4 B-abszorpciós oszlopon (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Az oszlopot 30 ml BRB-vel mostuk (pH 8,0), mielőtt az antitestet eluáltuk BRB-vel pH 3,0-nál. Az IgGl izotípusú anti-G mAb-t először nátrium-szulfáttal csaptuk ki 18% (tömeg/térf.) végső koncentrációnál. Az lg frakciót feloldottuk és dializáltuk BRB-ben (pH 8,0), majd átengedtük Protein A-Sepharose oszlopon, amint ezt korábban leírtuk. Az oszlopról leoldott Ig-t radioimmunassayval (RIA) mutatjuk ki, antigénként ERA-vírust alkalmazva [lásd. Dietschold és munkatársai: J. Virol. 44, 595-602 (1982)1 Az antitesteket vákuum-dialízissel koncentráltuk foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldattal (pH 7,4) (PBS) szemben. A fehéije-koncentrációt szarvasmarha-szérum albumint mint standardot alkalmazva határoztuk meg [lásd. Bramholl és munkatársai: Anal. Biochem. 31, 146-148 (1969)1 Anti-Id Ab-t készítettünk, amint ezt Staudt és munkatársai leírták (J. Exp. Med. 157, 687-704). Röviden, nőstény új-zélandi fehér nyulakat injektáltunk szubkután több helyen az emlősor mentén 300 pg, Protein ASepharose-n tisztított, Freund-féle komplett adjuvánsban (FCA) emulzióvá alakított mAb-vel. Két intramuszkuláris emlékeztető oltást adunk 100 pg antitesttel PBS-ben a 7. és 31. napon, és a szérumot 10 nappal később összegyűjtöttük. Minden egyes anti-idiotípus antiszérumot fajlagossá tettünk az idiotípus területekre Sepharose 4B oszlopon való átbocsátással, amely 11 oszlophoz vagy mAb 515-3-at (IgG2a) vagy 389-1-et (IgGl) kapcsoltunk, hogy eltávolítsuk az anti-izotípus Ab-t. Az ilyen oszlopokból nyert elfolyó folyadékok tartalmazták az idiotípusos determinánsokkal reaktív antitesteket. Az állandó területekhez tartozó antitesteket az mAb 515-3 és 389-1 immunadszorbens oszlopokról 0,1 mól/literes dietil-aminnal (pH 11,5) eluáltuk. Az egyes anti-Id Ab-kből az IgG-t Protein A-Sepharose kromatográfiával izoláltuk, amint ezt fentebb leírtuk. Az oszlop elfolyó folyadékjának reaktivitása nem-idiotípusos determinánsokkal elhanyagolható. Az anti-idiotípus antitestek jellemzése A fentebb előállított anti-Id Ab fajlagosságát és a keresztreaktív idiotípusok jelenlétét a különböző anti- G mAb-k között minden egyes anti-Id Ab készítményhez meghatároztuk RIA-val. Szilárd fázisú RIA-t alkalmaztunk, hogy az anti-Id Ab kötését méljük rögzített mAb-hez. Az egyes mAbket az ascites folyadék koncentrációjától függően hígítottuk karbonát-bikarbonát pufferban, pH 8,9, a következő mértékben: 509-6 (1:3000); 101-1 (1:6000); 719-3 (1:6000); 507-1 (1:6000); 1104-2 (1:16000). Ezután mindegyikből 25 p\-t polivinil mikrotitráló lemezek üregeihez adtunk (Dynatech laboratories). Ezeket az antitesteket hagytuk megszáradni az üregeken egy éjszakán át, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálással. Az üregeken a szabad kötőhelyeket blokkoltuk legalább 1 órán át 10% agamma lószérummal (GIBCO Laboratories) PBS-ben 0,08% nátrium-azid jelenlétében (PBSN). Anti-Id Ab hígításaiból 25 mikrolitereket adtunk hozzá, majd egy óra múlva szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a lemezeket élénken mossuk. A kötött anti-Id Ab-t 25 pl (30 000 cpm) jodogén módszerrel jelzett I25I kecske anti-nyúl IgG (Cappel Laboratories) hozzáadásával és szobahőmérsékleten további egy órán át végzett inkubálással mutattuk ki [lásd. Markwell és munkatársai: Biochemistry, 17,4807-4817 (1978)]. Az anti-Id Ab vagy radioaktív vizsgálóminta minden hígítását 10% agamma lószérumban végeztük PBSN-ben. A lemezeket nem-kötött vizsgáló mintamentessé mostuk és az egyes üregekhez kötött radioaktivitást gamma-számlálóban mértük. Az egyes anti-Id Ab készítmények titrálásának eredményei homológ és heterológ mAb-k ellen azt demonstrálják, hogy az egyes anti-Id Ab-k fajlagosak homológ Id mAb-jükre. Az idiotípus antitest parotopjára irányuló anti-idiotípus antitestek meghatározása Versengő RIA-t terveztünk meg, hogy megvizsgáljuk a veszettség-vírus G-nek az Id Ab és Anti-Id Ab közti kölcsönhatás megakadályozására vonatkozó képességét [lásd. Chaflin és munkatársai: J. Immunoi. 112, 1747-1756 (1974); Sher és munkatársai: J. Immunoi. 109. 176-178 (1972)1 A veszettség Gs-t alkalmaztuk versengő antigénként, mAb előtitrált szintjét inkubáltuk Gs kétszeres sorozat-hígításaival 1 órán át a standardizált anti-Id Ab hígítás hozzáadása előtt. A kötött antiszérumok menynyiségét egy 125I-vel jelzett kecske anti-nyúl antitest vizsgálóminta kötésével határoztuk meg. Az öt anti-Id Ab-ből háromnak a kötését megfelelő anti-G mAbjükhöz (509-6, 507-6 és 1104-2) a Gs gátolta. A maximális gátlás 20-50% között 6 pg/m\ Gs-el változott, de 12 194497 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
