194497. lajstromszámú szabadalom • Eljárás daganattal és vírussal szembeni immunválasz kiváltására alkalmas kompozíció előállítására
13 194 497 14 legalább 15% csökkenést figyeltünk meg még 0,75 /ig/ml Gs-el is. Az anti-Id Ab kötés teljes gátlásának képtelensége azt jelzi, hogy mind a keret, mind a parotop hely fajlagosság jelen van a három poliklonális anti- Id szérumban. Ezt bizonyítja az anti-Id Ab mAb-vel való reaktivitásának Western-folt analízise is, amelyet előzőleg nátrium dodecil szulfát-poliakrilamid gél elektroforézissel (SDS-PAGE) redukáló és nem redukáló körülmények között oldottunk meg. Mivel az antigén-kombináló hely az mAb redukciójával eltűnik, az anti-Id Ab reaktivitása redukált mAb-vel fajlagosságot mutatott a keret-determinánsokhoz. Bármilyen Gs-el történő jelentős kötés-gátlás távolléte anti-Id 101—1 Ab-hez vagy anti-Id 719-3 Ab-hez parotop fajlagosságok kisebb sokaságát vagy hiányát sugallja ezekben a szérumokban. Anti- (anti-idiotípus) antitest készítése A következő példák azt mutatják be, hogy az anti-G mAb antigén-kombináló helyével reaktív anti-Id Ab egy al-sokaságot (szubpopulációt) tartalmaz, amely utánozza az ezek által az anti-G mAb-k által felismert vírus epitopot és indukálhat immunológiai választ G-re. ICR egereket négyes csoportokban inokuláltunk szubkután 40 //g/egér Protein A-Sepharose-on tisztított, FCA-ban emuigáit anti-Id IgG-vel. Szubkután emlékeztető inokulálást végeztünk a 7. és 32. napon; minden alkalommal 40 //g anti-Id IgG-t tartalmazó Freund-féle inkomplett adjuvánsban. Öt nappal az utolsó emlékeztető inokulálás után az állatokat elvéreztettük a retroorbitális érközponton keresztül, és az összegyűjtött szérumokat ellenőriztük veszettség-vírus közömbösítő antitestre (VNA). Kontrollként egerek másik csoportja Protein A-Sepharose-on tisztított normál nyúl IgG-vel kapott immunizálást. A VNA szintjét az immunizált egerekben a gyors fluoreszcens fókusz gátlási vizsgálat egy módosított formájával határoztuk meg [lásd. Smith és munkatársai: a „Laboratory Techniques in Rabies” (Laboratóriumi technikák veszettséghez) c. kiadvány, 354-357. oldal (szerkesztők: M. Kaplan és H. Kaprowsi, 3. kiadás, 1973)1 Egérszérum kétszeres sorozathígításait készítettük el Microtiter II mikrotitráló lemezeken (Falcon Plastics) (50 //1/üreg) és 1 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk egyenlő térfogatú vírusoldattal, amely 10’ PFU/50 //1-t tartalmaz. Az inkubálást követően 50 p\ frissen tripszinezett BHK-21 sejteket (2.106 sejt/ml) adtunk minden egyes üreghez, összekevertük, és a szérum-vírussejt keverék 10 //1-es alikvotjait átvittük (két példányban) Terasaki lemezek üregeibe (Falcon Plastics). 20 órás inkubálás után a lemezeket először PBS-el, majd 80%-os (térf./térf.) desztillált vizes acetonnal leöblítettük, és 30 percen át rögzítettük 80%os acetonban szobahőmérsékleten. A lemezeket megszárítottuk és 30 percen át festettük 37 °C hőmérsékleten 5 //1/üreg nyúleredetű, fluoreszceinnel összekapcsolt anti-veszettség nukleokapszid antitesttel [lásd. Wiktor: Symp. Series Immunobioi. Standard, 21, 102-118 (1974)1 A kontroliüregek (amelyek tartalmaztak vírust, de antitestet nem) a sejtek mintegy 40%-áról mutatták ki, hogy tartalmaznak veszettség-vírus fajlagos zárványokat. A vírus-semlegesítés végpontját úgy határoztuk meg, mint annak a legnagyobb szérumhígításnak a reciprokát, amely 50%-kal képes csökkenteni a veszettség-vírussal fertőzött sejtek számát. A gyors fluoreszcens fókusz gátlási vizsgálat eredményeit az alábbi táblázatban mutatjuk be. Szignifikáns VNA titerek alakultak ki ERA törzsbeli veszettség-vírus ellen anti-Id 509-6 Ab-vel és anti-Id 1104-2 Ab-vel immunizált egerekben. A három másik anti(anti-Id) Ab nem közömbösítette az ERA-vírust. A kontrollkísérletek azt mutatták, hogy az immunizáláshoz használt egér anti-(normál nyúl IgG) Ab-nek, valamint az anti-Id Ab-nek nincs vírusközömbösítő aktivitása. Ezenkívül az anti-(anti-Id 509-6) szérumok előinkubálása anti-Id 509-6 Ab-vel eltávolította a közömbösítő aktivitást. Az előinkubálás normál nyúlszérummal viszont nem tette ezt. Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a kialakult VNA fajlagosságát, más veszettségvírusokat is alkalmaztunk a közömbösítési vizsgálatban. A veszettség-vírus CVS törzsét mind mAb 509-6-hoz, mind 1104-2-höz (az adatokat nem mutatjuk be) kötöttük, és a táblázat azt mutatja, hogy a CVS közömbösítette mind az anti-(anti-Id 509-6), mind az anti-(anti-Id 1104-2) szérumokat. Másrészt az ERA-vírus egyik variánsát, az RV 509-6- ot, amelynek olyan mutációja van az 509-6 epitopban, amely az mAb 509-6-al való kötő vagy közömbösítő aktivitás elvesztését eredményezi [lásd. Laton és munkatársai: J. Gen Virol. 64, 843-851 (1983)] az anti-(anti- Id 509-6) szérumok nem közömbösítették. Egy másik közömbösítésre semleges variánst, az RV194-2-t, az anti-(anti-Id 509-6) szérumok hatásosan közömbösítették. Korábbi eredmények azt demonstrálták, hogy az anti-G mAb 509-6 és 194-2 által felismert antigénhelyek teljesen függetlenek (lásd. Laton és munkatársai, fentebb idézett munka). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az anti-(anti-Id 509-6) szérumok csupán azzal az epitoppal reagálnak, amelyet az anti-G mAb 509-6 felismer, és így az anti-Id 509-6 Ab ezt az epitopot utánozza. TÁBLÁZAT Veszettség-vírus törzsek semlegesítése anti-(anti-Id) szérummat Egér-antiszérum ERA CVS Szülőtörzs RV-509-6 RV-194-2 Szülőtörzs Normál nyúl IgG 4 4 4 4 Anti-Id 509-6 32 4 64 64 Anti-Id 101-1 4 NV* NV NV Anti-Id 179-3 4 NV NV NV Anti-Id 507-1 4 NV NV NV Anti-Id 1104-2 128 4 4 64 RIO** 16 •16 16 32 +A legnagyobb szérumhígítás reciprokát, amely képes volt a fertőzött sejtek számát 50%-kal csökkenteni, vettük közömbösítési titemek. *Nem végeztük el. **Humán anti-veszettség Ig-t hígítottunk 0,2 nemzetközi egység/ml-re, és kétszeres sorozathígításokat inkubáltunk veszettség-vírussal. A fenti példák csupán a szemléltetés céljára szolgálnak, és nem kívánják korlátozni a találmány oltalmi körét, amelyet csak az igénypontok határolnak be. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás anti-idiotípus antitestek előállítására, amelyek azonosítanak egy olyan epitopot, amely egy antitumor vagy antivirus antitest parotopja, azzal jellemezve, hogy egy antitumor vagy antivirus antitestet veze-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
